番茄紅素與細(xì)胞壁多糖的關(guān)系

番茄紅素與細(xì)胞壁多糖的關(guān)系

番茄紅素是一種11個(gè)普通的雙鏈不規(guī)則碳?xì)浠衔?。這是一種非常重要的生物活性物質(zhì)。它對預(yù)防和治療乳腺癌、乳腺癌等癌癥、人類免疫功能和心血管疾病具有很大的潛力。目前國內(nèi)外應(yīng)用的番茄紅素的來源主要有2方面:植物提取法和微生物發(fā)酵法。用植物提取法制取番茄紅素,雖然原料來源廣泛易得,但是含量較低、副產(chǎn)物較多,原料供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響較大,使得生產(chǎn)成本較高;與此相比,微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)菌可通過基因改造而大幅提高產(chǎn)量,易于放大和工業(yè)化生產(chǎn)。目前,生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的主要菌種有三孢布拉氏霉(Blakesleatrispora)和紅酵母(Rhodotorular)。雖然與三孢布拉氏霉相比,紅酵母的單位產(chǎn)量比較低,但由于其具有營養(yǎng)要求簡單、生長周期短及菌體營養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點(diǎn),具有很高的實(shí)用價(jià)值和很好的工業(yè)開發(fā)前景。一般情況下,微生物合成的主要類胡蘿卜素,是番茄紅素經(jīng)過環(huán)化和氧化等之后的衍生物,如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等。因此,針對類胡蘿卜素這樣的一個(gè)合成途徑,可以從3方面提高番茄紅素的累積:1是要加強(qiáng)和促進(jìn)類胡蘿卜素合成途徑,2是要控制番茄紅素后續(xù)反應(yīng)的過程,阻止其環(huán)化反應(yīng),3是阻遏其他的競爭代謝途徑,使其代謝向有利于合成番茄紅素的方向進(jìn)行。本文就不同代謝調(diào)節(jié)物對番茄紅素合成的影響進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1病毒本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的1株產(chǎn)番茄紅素的黏紅酵母2.27。1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,上海融和醫(yī)藥公司;煙堿(95%),西安天則生物技術(shù)有限責(zé)任公司;雙氧水(含體積分?jǐn)?shù)30%H2O2的水溶液),廣州化學(xué)試劑廠;酮康唑,廣州迪越化工有限公司;青霉素,廣州美津生物技術(shù)有限公司。SHP-450D型生化培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SKYB2112B型恒溫?fù)u床,廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司;LD5-2A低速離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠;2802S型紫外分光光度計(jì),尤尼科(上海)儀器有限公司;Waters高效液相色譜儀1525,Waters紫外分光檢測器2487。1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件斜面活化培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸出粉10g/L,瓊脂20g/L,自然pH。液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸出粉10g/L,自然pH。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50g/L,蛋白胨15g/L,酵母粉10g/L,初始pH5,核黃素0.5mg/L,吐溫-801.5%。種子斜面活化培養(yǎng):挑黏紅酵母1環(huán),接入斜面活化培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)48h。液體種子培養(yǎng):從活化了的斜面種子中挑取培養(yǎng)2環(huán),接于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi),28℃下200r/min振蕩培養(yǎng)24h。液體發(fā)酵培養(yǎng):以5%的接種量,將液體種子接入到裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,在光照條件下,28℃,200r/min振蕩培養(yǎng)96h。1.4酵母泥的提取發(fā)酵結(jié)束后,取10mL液體發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中,以4000r/min離心10min,棄上清液,沉淀水洗后再次離心,得酵母泥,于55℃下過夜烘干,稱干質(zhì)量1.5酵母泥的制備發(fā)酵結(jié)束后,參照文獻(xiàn)采用熱酸法破壁,丙酮浸提:取發(fā)酵液10mL轉(zhuǎn)入離心管中,以4000r/min離心10min,沉淀水洗后得酵母泥;加入3mol/L的HCl溶液5mL,混合均勻后浸泡1.5h,然后再沸水浴4min,迅速冷卻,再4000r/min離心10min,得沉淀水洗2次,離心得到菌體殘片;加入丙酮9mL,混合均勻,浸提1h,4000r/min下離心10min,得到色素丙酮浸提液。1.6gc/ms分析將色素提取液用0.22μm的微孔濾膜過濾后,以高效液相色譜法(HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時(shí)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在相同條件下測定,根據(jù)峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。Waters-1525高效液相色譜儀;色譜柱為:AgilentHCC-18柱(5μm,250mm×4.6mm);Binary高效泵;檢測器為:Waters-2487,DoubleλAbsorbanceDetector;數(shù)據(jù)分析軟件:Breeze。高效液相色譜條件:流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=10∶90,檢測波長為472nm,流速為1.0mL/min,柱溫為28℃,進(jìn)樣量為10μL。2結(jié)果與分析2.1質(zhì)量濃度的確定準(zhǔn)確稱量2.5mg的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮溶解,定容于10mL的棕色容量瓶中,質(zhì)量濃度為250μg/mL。再分別稀釋成50、100、150、200、250μg/mL的質(zhì)量濃度梯度,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后HPLC檢測,數(shù)據(jù)處理,得到峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線為:y=10.892x,R2=0.9984。2.2煙堿對番茄紅素的影響在開始液態(tài)發(fā)酵后,分別在6、12、18、24、30h,以2.5mL/L的添加量加入煙堿,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,隨著時(shí)間的推移,加入煙堿后番茄紅素的產(chǎn)量先高后低,在24h加入時(shí)達(dá)到最大值11.51mg/L;生物量一直隨時(shí)間的延長而增大,在30h加入時(shí)達(dá)到最大值21.44g/L?？赡苁怯捎跓焿A對酵母菌細(xì)胞有一定的毒害作用,在發(fā)酵的早期加入會對黏紅酵母生長不利,因而生物量較低。綜合考慮,添加代謝調(diào)節(jié)物煙堿的時(shí)間為24h。2.3成番茄紅素的確定液態(tài)發(fā)酵至24h,添加2.5mL/L的煙堿后,再分別在發(fā)酵的48、54、60、66、72h,以400mg/L的量加入酮康唑,對黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖2所示。根據(jù)圖2可知,隨著酮康唑加入時(shí)間的推移,黏紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都先增大后減小,在發(fā)酵至60h時(shí)加入酮康唑時(shí)兩者都達(dá)到了最大值,分別為22.04g/L和87.27mg/L。由于酮康唑可以抑制真菌細(xì)胞膜中麥角固醇的合成,使得更多的前體物質(zhì)法尼基雙磷酸酯(FPP)用于合成番茄紅素,但過早的加入酮康唑,對酵母細(xì)胞的增殖會有一定的抑制作用,因此要在發(fā)酵達(dá)到穩(wěn)定期再加入,故最適宜加入時(shí)間為60h。2.4激素對黏紅酵母合成番茄紅素的影響在發(fā)酵至24h時(shí)加入2.5mL/L煙堿,60h時(shí)加入酮康唑400mg/L,然后分別在發(fā)酵的12、18、24、30和36h,加入青霉素1mg/L,對黏紅酵母合成番茄紅素的影響如圖3所示。從圖3可以看出,在發(fā)酵前期添加青霉素,黏紅酵母的番茄紅素產(chǎn)量先增大后減小,24h時(shí)達(dá)到最大值103.33mg/L。因此,作為MoG還原酶的激活劑的青霉素,最適宜加入時(shí)間為發(fā)酵至24h時(shí)。2.5紅酵母累積番茄紅素在發(fā)酵至24h時(shí)加入2.5mL/L煙堿和1mg/L青霉素,60h時(shí)加入酮康唑400mg/L,然后分別在發(fā)酵的24、30、36、42、48h,加入雙氧水量1.6mL/L,對紅酵母累積番茄紅素影響如圖4所示。從圖4可以看到,隨著雙氧水加入時(shí)間的向后推移,黏紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都是先增大后減小,42h加入雙氧水,生物量達(dá)到最大值25.98g/L;36h加入雙氧水,產(chǎn)量達(dá)到最大值160.96mg/L。由于酵母細(xì)胞對于雙氧水的氧化刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),從而促進(jìn)了番茄紅素的合成,但如果過早的加入,此時(shí)細(xì)胞濃度較低,對其繼續(xù)增殖不利,加入時(shí)間太晚,又會消耗掉一些已經(jīng)生成的番茄紅素,因此,雙氧水的最佳加入時(shí)間是黏紅酵母發(fā)酵至36h時(shí)。2.6dps優(yōu)化實(shí)驗(yàn)從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到幾種代謝調(diào)節(jié)物的最佳加入時(shí)間點(diǎn)為:煙堿在發(fā)酵至24h時(shí)加入,酮康唑在60h時(shí)加入,青霉素在24h時(shí)加入,雙氧水在36h時(shí)加入。為了進(jìn)一步提高其代謝調(diào)控的水平,用均勻試驗(yàn)的方法對各種調(diào)節(jié)物的添加量進(jìn)行了優(yōu)化,各因素及水平的選取見表1。由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,運(yùn)用組合N1可以得到黏紅酵母生物量和番茄紅素產(chǎn)量的最大值,即煙堿2.5mL/L,酮康唑600mg/L,青霉素4mg/L,雙氧水1.2mL/L的添加量時(shí),可以得到番茄紅素的最大產(chǎn)量176.97mg/L3底物合成所需的化合物本文研究了紅酵母在發(fā)酵產(chǎn)生番茄紅素過程中,添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑、麥角固醇抑制劑、青霉素和氧化劑對番茄紅素生物合成的影響。實(shí)驗(yàn)中以煙堿作為環(huán)化酶抑制劑的添加,可以阻遏類胡蘿卜合成中番茄紅素的環(huán)化,使得番茄紅素得以累積;由于麥角固醇和番茄紅素的合成有共同的前體物質(zhì)法尼基雙磷酸酯(FPP),因此酮康唑的加入抑制了麥角固醇的合成,使得更多的FPP用來合成番茄紅素,其產(chǎn)量必然增加;青霉素作為MoG還原酶的激活劑,可以增加前體物質(zhì)IDP的合成,促進(jìn)番茄紅素的合成;雙氧水為氧化劑,對黏紅酵母的刺激增強(qiáng)了番茄紅素的合成代謝