芍藥苷、馬錢苷與牛血清白蛋白的相互作用研究

芍藥苷、馬錢苷與牛血清白蛋白的相互作用研究

血清蛋白質(zhì)是血漿中最豐富的載體蛋白。蛋白大和藥物的相互作用是相對穩(wěn)定的結(jié)合部位，并隨著一定程度的空間構(gòu)象變化。而藥物進(jìn)入人體必須通過血漿的儲(chǔ)運(yùn)才能到達(dá)受體部位并產(chǎn)生藥效,因此研究藥物分子與蛋白的相互作用有利于從分子水平了解藥物的作用機(jī)理。采用熒光光譜等方法研究藥物與牛血清白蛋白(BSA)的相互結(jié)合作用已有報(bào)道,這對于理解BSA的運(yùn)輸作用機(jī)制,以及對新藥的設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)意義。芍藥苷(paeoniflorin)是一種雙環(huán)單萜苷類化合物,具有抗炎、保肝、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性,為中藥牡丹皮、白芍、赤芍等的活性成分之一。馬錢苷(loganin)是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物,具有降血糖、增強(qiáng)免疫、抗炎、抗休克、利尿、降壓等作用,在山茱萸等中藥材中含量較高。目前國內(nèi)外未見牛血清白蛋白與芍藥苷、馬錢苷相互作用的研究報(bào)道。本文采用熒光猝滅法、同步熒光光譜法和紫外光譜法研究了生理?xiàng)l件下芍藥苷和馬錢苷與牛血清白蛋白的相互作用,通過計(jì)算2種苷類分子與BSA的熱力學(xué)參數(shù),推`測芍藥苷和馬錢苷與BSA的相互作用機(jī)理。本研究對于闡明芍藥苷與馬錢苷在人體內(nèi)的運(yùn)輸及作用機(jī)制具有重要意義。1u3000藥品、制劑與標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制Caryeclipse型熒光分光光度計(jì)(美國瓦里安公司),TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析儀器有限責(zé)任公司),XS205DualRange分析天平(美國梅特勒托利多公司),PHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠),移液槍(20μL),81-2恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)。牛血清白蛋白(Sigma,純度≥98%),相對分子質(zhì)量為6.60×104。BSA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:準(zhǔn)確稱取BSA6.60mg,用去離子水溶解并定容至10mL量瓶中,即得1.0×10-5mol·L-1的溶液,置于4℃冰箱中保存?；瘜W(xué)對照品芍藥苷、馬錢苷(中國藥品生物制品檢定所)用乙醇分別配制成1.662×10-3mol·L-1和1.332×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液,水為去離子水。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。2熒光光譜的測定于10mL量瓶中依次加入0.5mol·L-1氯化鈉溶液2mL、pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液2mL、BSA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2mL,用去離子水稀釋至刻度,搖勻。取該溶液2mL置于1cm的熒光比色皿中,以280nm為激發(fā)波長,激發(fā)光譜狹縫與發(fā)射光譜狹縫寬度為5nm,在300～500nm范圍內(nèi)掃描熒光發(fā)射光譜。逐次將馬錢苷儲(chǔ)備液(或芍藥苷儲(chǔ)備液)加入比色皿中,置25℃或37℃恒溫水浴中(內(nèi)置微型磁力攪拌器)攪拌5min,以Δλ=60nm和Δλ=15nm測定其同步熒光光譜(激發(fā)光柵及發(fā)射光柵狹縫寬均為5nm),同時(shí)對該溶液的紫外光譜進(jìn)行測定。由于加入藥物的累加體積遠(yuǎn)小于熒光池中溶液的原始體積,故實(shí)驗(yàn)中忽略加入的藥物體積對濃度的影響。3結(jié)果與討論3.12相同條件下合成對bsa的影響蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化在一定程度上反映了蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)色團(tuán)本身及周圍微環(huán)境的變化,因此可以通過熒光光譜的變化推測小分子與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制。圖1為25℃溫度下BSA和BSA-芍藥苷復(fù)合物的熒光猝滅光譜。由圖可知,芍藥苷的加入沒有導(dǎo)致新熒光峰的產(chǎn)生,且隨著溶液中芍藥苷濃度的增加,BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,峰位置和峰形基本保持不變;相同條件下馬錢苷對BSA的熒光猝滅作用與芍藥苷類似(見圖2)?？梢?芍藥苷或馬錢苷與BSA間存在相互作用,并引起蛋白質(zhì)微環(huán)境及構(gòu)象的改變。圖3為芍藥苷、BSA和BSA-芍藥苷復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。由圖可見,隨著小分子藥物濃度的增加,溶液吸收峰(280nm)的吸收度增大,且譜圖的形狀發(fā)生了一定的改變,說明小分子與BSA之間發(fā)生了相互作用。在BSA中加入芍藥苷后,吸收峰位置藍(lán)移,藍(lán)移的發(fā)生說明體系的疏水性增加。相同條件下馬錢苷對BSA的紫外吸收光譜的影響參見圖4,可以看出,馬錢苷對BSA的作用與芍藥苷類似。以上結(jié)果驗(yàn)證了芍藥苷或馬錢苷和BSA的基態(tài)分子之間的相互作用。3.2stern-微織構(gòu)物對bsa的熒光u熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同可分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)結(jié)合常數(shù)KSV可判斷靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅作用。動(dòng)態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散,升高溫度導(dǎo)致擴(kuò)散加快,因此KSV將隨著溫度的升高而增大;若是靜態(tài)猝滅,升高溫度會(huì)導(dǎo)致配合物穩(wěn)定性降低,因此KSV將隨溫度的升高而減小。由于動(dòng)態(tài)猝滅只影響到熒光分子的激發(fā)態(tài),因而并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜;而在靜態(tài)猝滅中,基態(tài)配合物的生成往往會(huì)導(dǎo)致熒光物質(zhì)吸收光譜的改變。若芍藥苷和馬錢苷對BSA的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅,則作用過程應(yīng)遵循Stern-Volmer方程:F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)其中,F為有猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度,F0為無猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度,[Q]為猝滅劑濃度,KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù),τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s。根據(jù)Stern-Volmer方程,以猝滅劑濃度[Q]為橫坐標(biāo),以F0/F為縱坐標(biāo),繪制猝滅劑濃度對F0/F的曲線,即可求出動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV。分別測定了25℃和37℃下芍藥苷和馬錢苷對BSA熒光的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),不同溫度下的猝滅常數(shù)及相關(guān)參數(shù)列于表1,相關(guān)系數(shù)表明Stern-Volmer猝滅曲線有良好的線性關(guān)系。根據(jù)文獻(xiàn),各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1,而表1的結(jié)果顯示,芍藥苷和馬錢苷對BSA的熒光猝滅速率常數(shù)都遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù),且動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小,由此可以初步推斷芍藥苷與馬錢苷對BSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。3.3溫度對關(guān)于植物酚、馬錢苷與bsa的結(jié)合對于靜態(tài)猝滅方式,可以用Lineweaver-Burk方程計(jì)算靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLBLB:(F0-F)-1=F?100-1+K?1LBLB-1F?100-1[Q]-1(2)以(F0-F)-1對[Q]-1作雙倒數(shù)圖,由該直線的斜率和F0值,求得芍藥苷、馬錢苷與BSA的結(jié)合平衡常數(shù)如表2所示。由表2可知,2種溫度下的KLB值相差很小,說明芍藥苷、馬錢苷與BSA之間的結(jié)合受溫度變化的影響較小。2種苷類化合物與BSA的結(jié)合常數(shù)較大,因此可以在體內(nèi)被蛋白質(zhì)所儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)。3.4熒光bsa法藥物小分子與蛋白質(zhì)生物大分子之間的相互作用一般采用位點(diǎn)結(jié)合模型來描述:lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q](3)式中n為此反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn),KA為熒光猝滅反應(yīng)的平衡常數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作雙對數(shù)圖,由該直線的斜率,求得芍藥苷、馬錢苷與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù),即與BSA的摩爾比,如表3所示?？芍?芍藥苷與馬錢苷和BSA結(jié)合時(shí)約存在1個(gè)單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn),即大約1個(gè)芍藥苷分子或1個(gè)馬錢苷分子與1個(gè)BSA分子結(jié)合形成配合物。3.5bsa-山藥苷、馬錢苷體系的熱重分析藥物與生物大分子之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等,藥物不同,與蛋白質(zhì)作用力類型也不同。在配合物的形成過程中,其熱力學(xué)關(guān)系為:ΔG=-RTlnk(4)ΔH=RTIT2ln(K2/K1)/(T2-T1)(5)ΔS=(ΔH-ΔG)/T(6)式中ΔG為反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)摩爾吉布斯自由能變,ΔH為焓變,ΔS為熵變。當(dāng)溫度變化不大時(shí),結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)可看成常數(shù),根據(jù)熱力學(xué)公式可以得到結(jié)合反應(yīng)的ΔG、ΔH、ΔS等熱力學(xué)函數(shù)的變化值。根據(jù)不同溫度下BSA-芍藥苷、BSA-馬錢苷體系的猝滅常數(shù),計(jì)算得到的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)列于表4中。由表中數(shù)據(jù)可知,BSA-芍藥苷、BSA-馬錢苷體系的ΔH和ΔS均大于0,因此可以推測芍藥苷、馬錢苷與BSA分子間主要存在疏水作用力。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域又存在2個(gè)呈凹形的亞結(jié)構(gòu)域,彼此以槽口相對的方式形成3個(gè)圓筒狀疏水腔,芍藥苷和馬錢苷可能以嵌插的方式結(jié)合到BSA的疏水腔內(nèi)。2種化合物與BSA結(jié)合的ΔG<0,表明是一個(gè)自由能降低的分子作用過程,芍藥苷與馬錢苷可以自發(fā)地嵌插到BSA分子的疏水腔內(nèi)部,并引發(fā)BSA分子構(gòu)象的改變。3.6馬錢苷與bsa的同步熒光分析采用同步熒光光譜法進(jìn)行了芍藥苷、馬錢苷對BSA構(gòu)象影響的研究。當(dāng)△λ(△λ=λem-λex)=15nm時(shí),主要表現(xiàn)的是蛋白質(zhì)中酪氨酸的熒光光譜;△λ=60nm時(shí)表現(xiàn)的主要是色氨酸的光譜特征。蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的最大熒光發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān),最大發(fā)射波長紅移,表明此殘基所處環(huán)境極性增加,疏水性降低,蛋白結(jié)構(gòu)變疏松,反之亦然,故由此變化可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。圖5為加入不同濃度芍藥苷后BSA的同步熒光圖。由圖5可知,當(dāng)BSA濃度固定時(shí),隨著芍藥苷濃度的增加,BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低。圖5-A的最大發(fā)射波長略有藍(lán)移,而圖5-B幾乎沒有變化,表明色氨