板栗優(yōu)良品種的issr遺傳多樣性分析

板栗優(yōu)良品種的issr遺傳多樣性分析

蘑菇是云南省最重要的干果經(jīng)濟(jì)樹種之一。目前，種植面積約13.5萬hm，年產(chǎn)量2萬多t，產(chǎn)值2億多元。它在發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟(jì)和振興中發(fā)揮了重要作用。這就是所謂的“窮桿林”。云南省于1989年開始板栗良種選育工作,經(jīng)過20余年的不懈努力與探索,選育出了50多個(gè)新品種[1~4]。近年來,盡管關(guān)于板栗種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的研究已有一些報(bào)道,但是針對(duì)云南省優(yōu)良板栗品種種質(zhì)資源遺傳背景的研究卻未見報(bào)道。基于此,開展云南省優(yōu)良板栗種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究,對(duì)于了解云南優(yōu)良板栗種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)以及利用親緣關(guān)系分析指導(dǎo)遺傳育種工作有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。ISSR(簡單序列重復(fù)間區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù),作為一種操作快捷簡單、穩(wěn)定性高的分子標(biāo)記技術(shù),被廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位和種質(zhì)資源多樣性分析及鑒定等植物研究工作中[5~6]。本項(xiàng)研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)云南49個(gè)板栗優(yōu)良品種進(jìn)行分子遺傳分析,闡明這些優(yōu)良品種資源的遺傳多樣性,揭示各品種間的親緣關(guān)系,為今后種質(zhì)資源合理保護(hù)、遺傳育種以及品種鑒定等提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1葉的生長和來源以云南省峨山縣板栗優(yōu)良品種種質(zhì)資源圃中采集選育自7個(gè)來源地共計(jì)49個(gè)優(yōu)良板栗品種嫩葉樣品為實(shí)驗(yàn)材料(表1)。其中44個(gè)品種來自云南本地,5個(gè)來自北京。將采集到的嫩葉放入有硅膠的自封袋中,置于-70℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1總dna質(zhì)量檢測按照索萊寶植物基因組DNA提取試劑盒的說明提取云南板栗各品種的總DNA,用0.8%的瓊脂糖凝膠對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測,調(diào)節(jié)DNA終濃度為2ng/μL,放入-20℃冰箱備用。1.2.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測擴(kuò)增體系(25μL):2×mix12.5μL,0.3μmol/L引物,2ngDNA模板;反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,46.3~52.8℃退火45s,72℃延伸2min,35循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳緩沖液為0.5×TBE,120V恒壓電泳90min,電泳結(jié)束后用GeneGeniusBio圖像成像系統(tǒng)拍照?；谏鲜鰯U(kuò)增體系和反應(yīng)程序,進(jìn)行ISSR引物篩選,確定多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物及其退火溫度,用以所有樣品的ISSR擴(kuò)增。1.3構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣根據(jù)DNAMarker判讀電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的分子量大小及有無,同一位點(diǎn)有條帶的記為“1”,無條帶的記為“0”。采用Excel軟件對(duì)膠板樣本條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)化,構(gòu)建0/1數(shù)據(jù)矩陣。以Excel軟件的數(shù)據(jù)記錄為基礎(chǔ),利用DCFA1.1軟件將ISSR譜帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為POPGENE軟件適用文件,應(yīng)用POPGENE3.2軟件進(jìn)行遺傳參數(shù)分析,包括多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB%)、Nei’s(1973)遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離(D)和遺傳相似系數(shù)。根據(jù)各品種的Nei’遺傳距離和遺傳相似系數(shù),利用NTSYS-PC2.1軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析,確定各品種間的親緣關(guān)系。2結(jié)果與分析2.1pcr擴(kuò)增多態(tài)性經(jīng)篩選,獲得11條多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)用以所有樣品擴(kuò)增的ISSR引物。11條引物、相應(yīng)的退火溫度以及對(duì)49個(gè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果見表2。圖1為引物811和836對(duì)部分板栗樣品擴(kuò)增的圖譜。由表2可知,11條引物共擴(kuò)增出的86條DNA譜帶中有70條呈現(xiàn)多態(tài)性,多態(tài)性位點(diǎn)的百分率為81.40%。單個(gè)ISSR引物擴(kuò)增出的條帶在5~12之間,平均每條引物擴(kuò)增出8.18條,擴(kuò)增的條帶分布在230~2200bp之間。引物UBC-814、UBC-827、UBC-830和UBC-842擴(kuò)增出的DNA譜帶的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%;UBC-808擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)百分率最低,僅為55.56%。2.2種質(zhì)資源的多樣性經(jīng)POPGENE3.2軟件進(jìn)行遺傳參數(shù)計(jì)算及分析,結(jié)果顯示,板栗優(yōu)良品種種質(zhì)資源圃49份種質(zhì)資源的多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB%)為81.40%,Nei’s(1973)遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.228,Shannon信息指數(shù)(I)為0.350。以上數(shù)據(jù)表明云南優(yōu)良板栗品種種質(zhì)源圃中的板栗品種資源具有較高的遺傳多樣性。2.3富明縣第類品種-和-根據(jù)POPGENE計(jì)算出各品種的Nei’s遺傳距離和遺傳相似性系數(shù),利用Nei’s遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析,構(gòu)建聚類樹(圖2)。圖2顯示,49個(gè)品種被聚成2大類。第Ⅰ類共40個(gè)品種,涵蓋來源于峨山縣、宜良縣、富明縣的全部品種和部分祿勸縣、尋甸縣的品種;第Ⅱ類僅有9個(gè)品種,包括來自北京的全部品種和部分來自祿勸縣、尋甸縣的品種。遺傳距離0.158處,可以將第Ⅰ大類分為Ⅰ-ⅰ和Ⅰ-ⅱ2個(gè)亞類。Ⅰ-ⅰ有4個(gè)品種,全部是收集自祿勸縣的品種;Ⅰ-ⅱ有36個(gè)品種,包括來自富民縣、峨山縣和宜良縣的全部品種,還有來自云南省林業(yè)科學(xué)院的品種以及個(gè)別來自祿勸縣和尋甸縣品種也聚在這一類當(dāng)中,其中云栗29號(hào)和云栗30號(hào)遺傳一致性相同,說明云栗29號(hào)和云栗30號(hào)可能出現(xiàn)同種異名現(xiàn)象,遺傳距離在0.04處,收集自云南省林業(yè)科學(xué)院的品種(云栗18號(hào))和9個(gè)來自宜良的品種聚為一類,表明云南省林業(yè)科學(xué)院的品種和宜良縣的品種親緣關(guān)系比較近,聚類結(jié)果顯示地理來源相同的品種基本都聚在同一類中。3不同品種板栗的遺傳多樣性及聚類分析近年來,人們對(duì)板栗遺傳基礎(chǔ)的研究取得了突破性的進(jìn)展。黃宏文等[7~9]通過對(duì)中國板栗4個(gè)居群的人工栽培品種和茅栗、美洲栗自然居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析,并與歐洲栗的研究結(jié)果進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)中國板栗的遺傳多樣性水平顯著高于美洲栗和歐洲栗,認(rèn)為栗屬植物的遺傳多樣性中心為中國大陸;黃武剛等用10個(gè)微衛(wèi)星引物對(duì)陜西、云南、安徽和四川的4個(gè)中國栗野生居群69個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示居群間的遺傳關(guān)系與實(shí)際地理分布不完全相關(guān),其中陜西漢中居群具有最高的遺傳多樣性;程麗莉等利用葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)神龍架地區(qū)的野生板栗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明十堰地區(qū)野生板栗具有較高的多樣性,葉綠體單倍型分析更能直觀地表現(xiàn)野生板栗的區(qū)域分布規(guī)律;艾呈祥等和程水源等都采用ISSR分子標(biāo)記分別對(duì)山東和羅田的板栗進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明山東和羅田的板栗都具有豐富的遺傳基礎(chǔ)。本研究針對(duì)7個(gè)種源地實(shí)生選育獲得的49個(gè)優(yōu)良品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果49個(gè)優(yōu)良板栗品種資源顯示了較高的遺傳多樣性,品種的優(yōu)良性狀以及豐富的遺傳基礎(chǔ)為進(jìn)一步利用這些種質(zhì)開展品種改良工作奠定了良好的基礎(chǔ)。根據(jù)各品種的Nei’s遺傳距離,運(yùn)用UPGMA方法聚類分析,49個(gè)品種共分成2大類,其中第1大類又分為2個(gè)亞類。總體上,來源地相同的品種資源都聚為一類,表現(xiàn)出較為密切的親緣關(guān)系。說明板栗品種間的親緣關(guān)系與原產(chǎn)地關(guān)系較大。板栗為雌雄同株,異花授粉,同一地區(qū)植株間相互授粉的幾率較高,基因交流頻繁,導(dǎo)致同一地區(qū)植株間的遺傳基礎(chǔ)趨于相似。另外,聚類結(jié)果中也有個(gè)別不同來源地的品種聚在一類