牡丹組織培養(yǎng)過程中褐化的預(yù)防與控制

牡丹組織培養(yǎng)過程中褐化的預(yù)防與控制

牡丹在中國的種植已經(jīng)有1500多年的歷史了。牡丹廣泛分布于我國,作為我國原生的、古老的特有植物是研究栽培植物起源、人工選擇理論,進(jìn)行科學(xué)試驗(yàn)的良好材料。牡丹具有特殊的藥用價(jià)值、觀賞價(jià)值以及較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但其自然繁殖系數(shù)小、繁殖速度慢,而且生產(chǎn)周期相對(duì)較長,這些都嚴(yán)重地影響并制約了牡丹的規(guī)模化生產(chǎn)。到目前為止,國內(nèi)外的科研人員已經(jīng)對(duì)牡丹的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了一些研究,并取得了一定的進(jìn)展,但在生產(chǎn)工藝上還存在外植體污染率高、褐化嚴(yán)重、生根與移栽成活率低等問題。這使得以組織培養(yǎng)培方式繁殖牡丹還難以成為可行的商業(yè)化生產(chǎn)方式。其中,褐化現(xiàn)象不僅影響牡丹外植體與繼代植株的正常生長與分化增殖,而且還影響愈傷組織的誘導(dǎo)。而在組織培養(yǎng)培過程中往往會(huì)因褐化嚴(yán)重而造成愈傷組織難以繼代保存。同時(shí),褐化還在一定程度上影響組培苗誘導(dǎo)生根,從而直接導(dǎo)致植株分化過程中根的形成及發(fā)育不良,而有些植株形成了根,卻因褐化嚴(yán)重而腐爛死亡,這些都給組培苗最終的移栽成活造成了嚴(yán)重的影響。因此,本研究從抑止褐化的角度,對(duì)牡丹組培快繁技術(shù)的重要影響因子進(jìn)行了較為全面的研究。1材料和方法1.1丹實(shí)生苗腋芽于2005年3月取自山東菏澤地區(qū)露地栽培4年生品種為青龍臥墨池的牡丹實(shí)生苗。該品種牡丹組培苗、愈傷組織及試驗(yàn)試劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、結(jié)冷膠(Phytagel)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、抗壞血酸(VC)、銅試劑(DDTC)均由北京林業(yè)大學(xué)林果花卉良種繁育研究中心提供。1.2測(cè)試方法1.2.1種子處理和接種①消毒處理:將清洗干凈的外植體在自來水下沖洗1h,然后以70%的乙醇表面滅菌30s,然后用5%的NaClO滅菌14min,再用無菌水沖洗4次,每次3min,然后放置在已消毒的培養(yǎng)皿中,撥去鱗片,將芽接種到MS基本培養(yǎng)基中。②暗培養(yǎng)處理:外植體接種后進(jìn)行5d的暗培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng),以正常培養(yǎng)的材料為對(duì)照。對(duì)照與處理各15個(gè)芽。③激素處理:分別在MS基本培養(yǎng)基中添加濃度為0.5g·L-1和1.0g·L-1的6-BA,以不加激素的處理為對(duì)照。每種處理接種20個(gè)芽。④硬度處理:分別在基本培養(yǎng)基中添加濃度為3.0,6.0,9.0g·L-1的瓊脂,每處理接種15芽。1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備①繼代抑褐處理:為8個(gè)處理,分別在培養(yǎng)基中各添加5種濃度的VC、DDTC、Na2S2O3和PVP,添加3.0g·L-1、6.0g·L-1的瓊脂和1.5g·L-1的結(jié)冷膠。②生根抑褐處理:為2個(gè)處理,分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加4種濃度的PVP和1.2g·L-1的結(jié)冷膠。以上每處理20株苗,以普通繼代和誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對(duì)照,重復(fù)兩次,隨時(shí)觀察,30d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.2.3愈傷組織的制備①暗培養(yǎng)處理:將接種后的愈傷組織進(jìn)行7d的暗培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng),以正常培養(yǎng)的材料為對(duì)照。②液體懸浮培養(yǎng):將愈傷組織接入未添加瓊脂的液體培養(yǎng)基中,以正常培養(yǎng)的材料為對(duì)照。③添加吸附劑及更換固體支持物:分別在培養(yǎng)基中添加1.0,3.0,5.0g·L-1的PVP,以及1.2g·L-1的結(jié)冷膠。將愈傷組織切割成體積大小為1cm3,每瓶接4塊愈傷,每處理5瓶.重復(fù)2次。定期進(jìn)行觀察,于30d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。1.2.4培養(yǎng)基和試劑基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,加蔗糖30g·L-1,瓊脂6.0g·L-1。繼代培養(yǎng)基添加1.0mg·L-16-BA。生根培養(yǎng)基添加2.0mg·L-1IBA。愈傷繼代培養(yǎng)基添加1.5mg·L-1IBA和2.0mg·L-1NAA。pH值為6.0。培養(yǎng)溫度為(23±3)℃,每天光照14h,光照強(qiáng)度為2～3klx。2結(jié)果與分析2.1外植體的活性外植體消毒處理后,經(jīng)過5d的暗培養(yǎng),觀察發(fā)現(xiàn)與在光照下培養(yǎng)的材料比較,褐化與死亡芽數(shù)都較低(表1)。再經(jīng)過14d光照培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其褐化程度與正常光照培養(yǎng)的外植體基本相同。雖然經(jīng)過暗培養(yǎng)的外植體褐化有所緩解,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,褐化程度也隨之加重。這可能是因?yàn)榘蹬囵B(yǎng)只是暫時(shí)降低了多酚氧化酶的活性,一旦恢復(fù)正常培養(yǎng),其活性也馬上活躍起來。6-BA是牡丹組織培養(yǎng)中常用的植物激素,很多試驗(yàn)在外植體的啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)就進(jìn)行添加。本試驗(yàn)選擇了2個(gè)濃度,從表2中可以看出,隨著6-BA使用濃度的增加,牡丹的褐化與死亡數(shù)也增加,而且褐化程度也加劇了。原因有可能是分裂素類能夠促近酚類化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性提高。表3結(jié)果表明,培養(yǎng)基的硬度對(duì)牡丹外植體的褐化有很大影響。使用3.0g·L-1的瓊脂,培養(yǎng)基呈半液體狀,接種的外植體很容易在培養(yǎng)基中倒伏。培養(yǎng)5d時(shí)其褐化的程度很大,培養(yǎng)14d時(shí)外植體大部分褐化死亡,加大瓊脂的用量,可以增加培養(yǎng)基的硬度。當(dāng)瓊脂使用量為9.0g·L-1時(shí),5d時(shí)褐化程度很輕,觀察到外植體切口只有少量褐色物質(zhì),但是14d后其褐化程度仍然很高。這可能是較高的培養(yǎng)基硬度限制了外植體啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)褐化物質(zhì)的外滲,使得有毒物質(zhì)難以擴(kuò)散,因此造成了對(duì)外植體的危害,以致培養(yǎng)后期的褐化率仍然很高。2.2添加銅試劑后植株的生長狀況添加PVP后,植株褐化得到緩解(表4),僅有少數(shù)植株表現(xiàn)出輕微褐化。植株生長良好,莖段伸長明顯,增殖度高,其中當(dāng)添加量為0.3g·L-1時(shí)增殖度達(dá)最高,為1.59。但隨著用量增加,增殖有減緩的趨勢(shì)。添加Na2S2O3后,重度褐化株數(shù)減少,但總體褐化現(xiàn)象并未得到緩解,反而比對(duì)照嚴(yán)重,當(dāng)使用濃度為0.1g·L-1時(shí),增殖度最高,為1.33。隨使用濃度增加,增殖度開始下降,并出現(xiàn)大量黃葉,褐化也逐漸加重。加入銅試劑后,褐化物質(zhì)向四周的擴(kuò)散得到抑制,但褐化程度加重。從使用量為1.0g·L-1開始,植株100%褐化,增殖度下降。在添加VC的培養(yǎng)基中,在濃度為0.1g·L-1時(shí),僅有少量植株出現(xiàn)褐化,而且程度輕微,植株生長正常。隨著濃度的增加,褐化現(xiàn)象逐漸消失,但植株生長不良,從添加濃度0.5g·L-1開始出現(xiàn)葉片大量黃化,并且有植株開始死亡,當(dāng)用量達(dá)到0.9g·L-1時(shí)全部死亡。在一般培養(yǎng)基中褐化現(xiàn)象普遍發(fā)生,植株正常生長,增殖度為1.56。在半固體培養(yǎng)基中褐化并未得到抑制,少數(shù)植株褐化嚴(yán)重,并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,增殖度為1.48。在添加結(jié)冷膠的固體培養(yǎng)基中,褐化現(xiàn)象得到明顯緩解,褐化物質(zhì)在培養(yǎng)基中迅速擴(kuò)散,植株生長狀況良好,增殖度遠(yuǎn)高于對(duì)照,為2.59。牡丹在進(jìn)行根原基誘導(dǎo)時(shí),因?yàn)楹只瘒?yán)重,一些材料出現(xiàn)基部壞死,形成碳化狀硬殼,通過添加吸附劑與改變固體支持物可以緩解褐化。牡丹組培苗的生根分為2步,先是進(jìn)行誘導(dǎo)生根,然后是生根培養(yǎng)。誘導(dǎo)生根時(shí)植株基部先形成愈傷組織,然后生長出根。從表5中就可以看出,結(jié)冷膠抑褐效果比較好,雖然植株在培養(yǎng)基中仍然褐化,但褐化物質(zhì)可以得到迅速擴(kuò)散,而不是滯留在植株基部的愈傷組織周圍,因而對(duì)植株的毒害也比較小。PVP的抑褐效果也很好,但它的吸附作用卻在一定程度上影響了愈傷組織的正常形成。2.3愈傷組織的生長從表6可以看出,在正常光照和暗培養(yǎng)兩種處理中,都有褐化現(xiàn)象的發(fā)生。但就褐化程度來看,暗培養(yǎng)較輕,為2級(jí)。而在正常照光條件下為3級(jí),愈傷顏色為淡褐色或褐色,褐化嚴(yán)重的愈傷死亡,整個(gè)培養(yǎng)基都變成暗褐色。懸浮培養(yǎng)的愈傷組織雖然死亡率較暗培養(yǎng)的多,但成活的愈傷組織增殖快,而且生長良好。這說明光照是加劇愈傷褐化的重要原因,而愈傷組織本身的褐化產(chǎn)物加重了其對(duì)自身的毒害,因?yàn)楹只潭鹊募觿《罱K導(dǎo)致植株的死亡。PVP和結(jié)冷膠對(duì)愈傷組織褐化的防止差不多有同樣的效用,從表7可看出,當(dāng)PVP的使用量為5.0g·L-1時(shí),褐化為零,但愈傷的生長緩慢。3牡丹花組培褐化防治文獻(xiàn)回顧在植物組織培養(yǎng)中,褐化指的是培養(yǎng)材料在誘導(dǎo)脫分化或在分化過程中,向培養(yǎng)基中釋放出褐色物質(zhì),使其變色,并隨之加重變褐而最終死亡的現(xiàn)象。誘發(fā)褐化現(xiàn)象發(fā)生的原因有很多,如基因型、材料的年齡和大小、取材時(shí)間和部位、光照、溫度以及在培養(yǎng)時(shí)植物細(xì)胞受傷、衰老或是發(fā)生病變等。多數(shù)學(xué)者都認(rèn)為其機(jī)理主要是由多酚氧化酶(PPO)作用于其底物酚類物質(zhì)而引起的。PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一類末端氧化酶,酚類物質(zhì)也是植物界中種類最多,分布最廣的一種次生代謝物質(zhì)。PPO催化酚類化合物形成醌和水,醌再經(jīng)非酶促聚合,形成對(duì)植物材料產(chǎn)生毒害作用的褐色物質(zhì)。目前關(guān)于牡丹組培褐化防治的報(bào)道,僅限于外植體和葉柄培養(yǎng)兩方面。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,對(duì)牡丹組培整個(gè)過程中褐化的防治進(jìn)行了研究。試驗(yàn)所采用的抑褐劑根據(jù)其作用機(jī)理一般可分為防止酚氧化的抗氧化劑和吸收酚類物質(zhì)的吸收劑兩大類?？寡趸瘎￢C是一種酚氧化酶抑制物,它可以將該酶的Cu2+還原成Cu+,而DDTC和Na2S2O3則是影響酚類化合物與酶的結(jié)合。PVP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑,在生化分離制備中常用作酚類物質(zhì)和細(xì)胞器的保護(hù)劑,因此PVP被許多學(xué)者用于防止褐化的主要物質(zhì)。DDTC和Na2S2O3在本試驗(yàn)中,加劇了牡丹褐化的發(fā)生。這說明一方面是由于植物材料的不同,抑褐劑的效果也不同;另一方面也表明牡丹組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象的發(fā)生可能是由多種因素綜合作用的結(jié)果,而不是僅與多酚氧化酶活性有關(guān),也可能與其總酚含量有關(guān),或是與細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)和PPO的區(qū)域性分布有關(guān)。活性炭在培養(yǎng)基中僅是提供暗環(huán)境,它起到的吸附作用其實(shí)并不大,這與Msrtineau和Hanson的觀點(diǎn)相反,試驗(yàn)中沒有應(yīng)用。試驗(yàn)應(yīng)用了結(jié)冷膠作為培養(yǎng)基固化劑替代物,作為新型的微生物膠體材料它可在極低的用量下即產(chǎn)生澄清透明的凝膠,而且穩(wěn)定性好。結(jié)冷膠及PVP的抑褐效果最好,牡丹組織培養(yǎng)物質(zhì)的褐化都能夠得到緩解。但隨著PVP用量的增加,大部分組織培養(yǎng)物質(zhì)增殖度也隨之下降,這應(yīng)該與P