白組培快繁技術(shù)研究

白組培快繁技術(shù)研究

白俄羅斯是白俄羅斯科的一種多年生草本植物?；ㄆ跒?月至5月。她的花是紫色的，形狀很奇怪。這是一種理想的耐蔭花卉植物，可以作為栽培和切割材料的最佳基質(zhì)。白芨不僅具有較高觀賞價值,亦是我國常用的中藥材之一,以干燥塊莖入藥,具有收斂止血、消腫生肌等功效。此外,白芨莖中還含有較高的白芨膠,具有特殊的黏度特性,可作為增稠劑、混懸劑、保濕劑和助乳化劑等應(yīng)用于化妝品中,具有良好的效果。因其極高的觀賞藥用及經(jīng)濟價值,野生白芨遭到了無限制人工采挖。同時,由于白芨種子自然條件下繁殖困難,野生白芨資源急劇減少。白芨目前已被國家列為珍稀瀕危的保護植物。在其野生資源日益減少的情況下,大力推廣人工栽培、并探索其行之有效的快速繁殖技術(shù),可在解決其由于資源短缺制約白芨產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時,實現(xiàn)對野生白芨資源的有效保護。白芨常規(guī)以分生繁殖為主,但分生繁殖系數(shù)低,生長周期較長,而且耗種量大,不宜進行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。利用無菌播種技術(shù),通過組織培養(yǎng)方法可以快速繁殖大量種苗,遠較分株繁殖快捷高效。目前,雖然白芨組織培養(yǎng)和設(shè)施栽培等人工繁育關(guān)鍵技術(shù)得到了一定的發(fā)展,但是還沒有組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的報道。因此,本研究的目的在于建立一套簡單實用且易推廣的白芨組培快繁技術(shù)程序,為白芨的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及對野生白芨資源的有效保護提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1試驗材料白芨成熟未開裂的長卵圓形蒴果、花莖和地下莖。1.2測試方法1.2.1培養(yǎng)基的制備外植體材料首先用流水沖洗20min,再用小毛刷蘸洗衣粉溶液輕輕刷洗其表面,用流水沖洗干凈。在超凈工作臺上,用體積分數(shù)為75%酒精溶液浸泡30s,然后轉(zhuǎn)入1g/L的HgCl2溶液中進行表面消毒6~10min,再用無菌水沖洗6次,吸干表面水分?；◤角腥啥瞬⒖v切成2半切口向下接到培養(yǎng)基上;塊莖每個切成4~6份接到培養(yǎng)基上;蒴果縱切,將粉末狀的細微種子均勻地撒于培養(yǎng)基上。每種外植體每次均接30瓶培養(yǎng)基,做3次重復(fù)實驗。1.2.2胞分裂素和生長素的影響以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,采用完全隨機試驗設(shè)計方法,研究細胞分裂素(6-BA、KT)和生長素(2,4-D、NAA)對白芨原球莖誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)21d后統(tǒng)計原球莖的誘導(dǎo)率。原球莖誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的原球莖個數(shù)/接種的外植體個數(shù)(種子粒數(shù))。1.2.3白苗的生根培養(yǎng)將分化出的小芽接入由不同濃度細胞分裂素6-BA和生長素NAA配比組成的9種培養(yǎng)基,研究白芨苗的生根數(shù),根長,葉片數(shù),葉長和葉寬,以取得白芨一步成苗的最適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基設(shè)15瓶,每瓶均接入6株白芨小芽,培養(yǎng)30d后,記錄各數(shù)據(jù)。1.2.4基質(zhì)選擇與栽植選擇生長勢旺盛,葉片數(shù)多且根系良好的瓶苗,打開瓶蓋,室內(nèi)或95%遮光率的大棚內(nèi)放置3~5d,然后小心取出瓶苗,洗凈根上附著的培養(yǎng)基。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計研究蛭石、珍珠巖、泥炭土+蛭石、泥炭土+珍珠巖四種基質(zhì)對白芨組培苗移栽成活的影響。栽苗后注意遮光率和提高空氣濕度,定期做好觀察記錄。30d后分別在每個基質(zhì)中抽取50株有代表性的苗進行調(diào)查分析,測每組內(nèi)苗的成活率、植物球莖直徑、苗高、葉片數(shù)、葉寬。1.3月光和光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃,光照1800~2500lx,每天光照12h;誘導(dǎo)和增殖生根培養(yǎng)均采用MS培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,pH6.5,瓊脂7g/L。2結(jié)果與分析2.1白果皮的生長分別以白芨蒴果、花莖和地下莖為外植體進行組織培養(yǎng),結(jié)果表明,不同外植體類型的污染率都是隨著消毒時間的增加而減少,培養(yǎng)1個月后,消毒滅菌10min的白芨蒴果(種子)的成活率可高達96.67%,平均污染率僅為3.33%,顯著低于相同處理條件下的地下莖和花莖平均感菌率(表1)。此外,以白芨花莖和地下莖作為繁殖材料,培養(yǎng)一段時間后地下莖變綠隨后變褐色,花莖雖也有膨大的現(xiàn)象,但更換多種培養(yǎng)基和重復(fù)多次實驗均未誘導(dǎo)出愈傷組織或芽;而以白芨種子為培養(yǎng)材料,通過簡單培養(yǎng)即可誘導(dǎo)出白芨原球莖。由此可見,白芨組織培養(yǎng)以蒴果(種子)為外植體的培養(yǎng)效果最好。2.2培養(yǎng)基及酶誘導(dǎo)的效果白芨種子播種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上約1周后吸水膨脹,并由黃褐色變成淡綠色,進一步形成綠色小球體狀(即原球莖)。試驗結(jié)果表明(表2):在培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L中,原球莖誘導(dǎo)率只有5%(處理1)。將處理1中0.5mg/L的2,4-D改為等濃度的NAA(處理2),可使原球莖的平均誘導(dǎo)率由5%提高到90%,提高了17倍。說明在1mg/L細胞分裂素6-BA存在情況下,與2,4-D相比,NAA更有利于白芨原球莖的誘導(dǎo)。當(dāng)保持培養(yǎng)基中的2,4-D濃度(0.5mg/L)不變,將處理1中1.0mg/L的細胞分裂素6-BA改為等濃度的KT(處理4),原球莖的平均誘導(dǎo)率則有5%提高到70%,提高了13倍。說明在0.5mg/L2,4-D存在情況下,與6-BA相比,KT更有利于白芨原球莖的誘導(dǎo)。而在NAA濃度(0.5mg/L)一定的條件下,等濃度的細胞分裂素6-BA或KT處理,對白芨原球莖誘導(dǎo)效果相同(處理2和處理3)。因此,在節(jié)約成本的情況下,僅采用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的培養(yǎng)基(處理2)對白芨原球莖進行誘導(dǎo),便能達到很好的效果。但與生長素2,4-D搭配時,KT比6-BA的誘導(dǎo)效果好(處理1和處理4)。在上述不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1個月后,原球莖頂部出現(xiàn)可見幼葉,不同培養(yǎng)基對白芨芽分化的誘導(dǎo)存在較明顯的差異。處理1中誘導(dǎo)的白芨小芽發(fā)黃,略見綠色,雖然處理4原球莖誘導(dǎo)率可以達到70%,但黃化現(xiàn)象較處理1更嚴重,繼續(xù)培養(yǎng),芽分化的誘導(dǎo)效果很差。處理2和3中原球莖誘導(dǎo)分化效果較好,其中處理3中的小苗每株平均有兩小葉,而處理2每株僅有一片小葉。就整齊度而言,處理3芽分化效果更好;就苗高而言,處理2和處理3誘導(dǎo)的白芨平均苗高分別為0.3cm和0.5cm。由此可見,對于白芨芽的分化誘導(dǎo),處理3效果最好。綜合考慮白芨原球莖誘導(dǎo)和芽分化的效果,篩選出白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L(處理3),在該培養(yǎng)基中的原球莖平均誘導(dǎo)率可達90%,且誘導(dǎo)芽的分化效果最好。2.3ba濃度對白植株生長的影響將分化出的小芽轉(zhuǎn)接入含不同濃度6-BA和NAA配比組成的9種培養(yǎng)基中,以篩選白芨最佳壯苗生根培養(yǎng)基配方。由表3可以看出:每株苗葉片數(shù)最多的4號培養(yǎng)基,其次是處理2,且其葉長和葉寬值都較大。處理2、3和7,處理4和5,處理6和8之間的實驗結(jié)果表明:在NAA濃度相同的條件下,植株葉片數(shù)、葉長和葉寬隨BA濃度的增加而減少。而在BA濃度相同的條件下(處理5和6,處理7、8和9),植株葉片數(shù)、葉長和葉寬隨NAA濃度的增加有降低趨勢,NAA保持在0.5mg/L更有利于植株生長。說明細胞分裂素與生長素只有以一定適宜濃度配比,白芨組織培養(yǎng)才能獲得較好的生長效果。9種培養(yǎng)基中的苗都能生根,綜合考察苗的生根數(shù)和根長,效果較好的處理為3、4和5,其中生長的植株平均根數(shù)分別為:7.4條、7.2條和6.6條,平均根長分別為:2.23,1.54,2.50cm。本試驗采用的是壯苗和生根培養(yǎng)一步成苗的方法,對白芨壯苗培養(yǎng)效果較好的培養(yǎng)基為處理2和處理4,生根較好的培養(yǎng)基為處理3、4和5,所以壯苗培養(yǎng)和生根效果都較好的培養(yǎng)基為處理4,即:MS+6-BA0.45mg/L+NAA0.4mg/L。2.4白的生長能力從表4可以看出不同基質(zhì)移栽處理對白芨成活有不同的影響?？傮w上來說用蛭石作為基質(zhì)來移栽白芨的試管苗的生長能力較強,存活率可達95%以上;在成活苗的平均根數(shù)、植物球根直徑、苗高葉寬的數(shù)據(jù)對比分析中,可以得出用蛭石作為基質(zhì)的效果是最好的,而以珍珠巖作為基質(zhì)的移栽效果不理想。添加泥炭土的混合基質(zhì)對移栽效果也沒用明顯的改變。3培養(yǎng)基的選擇本實驗以白芨種子為培養(yǎng)材料,通過簡單培養(yǎng)即可誘導(dǎo)出白芨原球莖并進行芽的分化,且壯苗培養(yǎng)與生根可同時進行,即一步成苗,既節(jié)約了繁殖成本和培養(yǎng)時間,且操作簡單易行便于推廣,符合市場要求(圖版)。前人在對白芨原球莖的誘導(dǎo)過程中,培養(yǎng)基中都不同程度的添加了馬鈴薯泥、香蕉泥和椰子汁等輔助成分,而本實驗僅采用常規(guī)激素組合對其進行誘導(dǎo),效果同樣顯著(表2),所以在大量生產(chǎn)中,可以從節(jié)約繁殖成本及便于操作的角度考慮使用簡單培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)白芨原球莖。但是同大多數(shù)蘭科植物一樣,培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的種類及濃度配比對白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化方向起著決定性的作用。研究發(fā)現(xiàn)生長素2,4-D不僅抑制白芨原球莖的誘導(dǎo),也不適宜于其原球莖的分化。而等濃度的NAA與KT或6-BA的配合使用對白芨原球莖的誘導(dǎo)效果很好(表2)。在壯苗生根培養(yǎng)過程中,當(dāng)培養(yǎng)基中生長素濃度相對細胞分裂素而言過高時,趨向于長根,抑制莖芽的生長(處理6),而當(dāng)培養(yǎng)基中細胞分裂素相對生長素而言過高時,雖然有明顯的芽分化,但使其分化苗不能正常生長而死亡(處理7)。說明在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)階段,為了促進芽器官的分化或壯苗生根培養(yǎng),應(yīng)適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。實驗篩選出白芨原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L。白芨為生根較容易植物,各處理培養(yǎng)基都促進了白芨生根,綜合調(diào)查白芨的壯苗指標(biāo)和生根情況,發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)基為MS+6-BA0.45mg/L+NAA0.4mg/L作用較明顯。瓶苗移栽實驗結(jié)果表明,白芨無菌苗最適宜的移栽生長基質(zhì)為蛭石(表4)。蛭石具有良好的保水透氣性能,這也與白芨性喜溫暖而又濕潤的環(huán)境,要求排水良好含腐殖土較多的沙壤土的特性吻合。此外,白芨瓶苗的葉較薄,出瓶后極易脫水而使葉邊緣焦枯,從而影響成活率,保證移栽前期的空氣濕度在80%~90%,可提高移栽成活率。本實驗主要采用的是種子萌發(fā)方法繁殖,雖然增殖系數(shù)不高,但成苗迅速且苗的質(zhì)量好。本研究中,以種子作為外植體,30d就開始萌動,60d小苗就分化完全,這也與韋卡婭等的研究結(jié)果相一致。研究表明利用幼嫩塊莖作為外植體誘導(dǎo)叢生芽,60d才有小芽形成,且分化效率不高。此外,白芨塊莖長期在地下,受病菌和泥土污染嚴重,很難徹底滅菌,而且由于分