馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)研究

馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)研究

甘薯是屬于茄子科的一種四度性植物。通常，它使用莖進行無性繁殖。在繁殖過程中，病毒和細(xì)菌容易受到污染，產(chǎn)量降低。通過幾代的積累，可以實現(xiàn)種子退化。利用無菌操作通過組織和細(xì)胞培養(yǎng),不但可產(chǎn)生去病毒的試管苗,還可以縮短生長周期,而進行大批量的快速繁殖。近20年來,我國在馬鈴薯組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)方面也有一些研究報告發(fā)表。我國學(xué)者多采用MS培養(yǎng)基和勒新培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,用馬鈴薯不同部位作外植體進行離體培養(yǎng)。如中國科學(xué)院遺傳研究所(1976)以MS培養(yǎng)莖尖;朱明凱等(1985)以MS培養(yǎng)花藥;雙寶等(1995)用MS培養(yǎng)葉片;李燦輝等(1998)也發(fā)表過有關(guān)馬鈴薯組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究報告。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,研究了用2,4-D、NAA、BA的不同濃度及組合,對馬鈴薯的莖尖、莖段、塊莖進行愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的誘導(dǎo)效果。1材料和方法1.1材料表面采用生長健壯的馬鈴薯成年苗和馬鈴薯塊莖作外植體。按照常規(guī)方法進行表面滅菌處理。1.2外植體誘導(dǎo)芽的制備誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基,以MS為基本培養(yǎng)基,蔗糖30g/L,瓊脂8g/L,并附加不同種類和濃度的激素(表1),培養(yǎng)基滅菌前調(diào)pH值5.8～6.0,在121℃下滅菌18min(以下培養(yǎng)基均同此處理)。將外植體切成0.5～1.0cm的小段,每瓶接種3塊,每處理接種10瓶。培養(yǎng)溫度(23±2)℃,光照2500Lx,12h/d。誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基為:A.MS+NAA0.2mg/L(激素濃度均同此單位)+BA0.1;B.MS+NAA0.2+BA0.2;C.MS+NAA0.2+BA0.3。1.3小苗、馬鈴薯小苗的誘導(dǎo)生根采用MS+NAA0.4+BA1.0,每瓶接種一個芽,25～30d后將誘導(dǎo)的叢生芽分離,將其中生長、長勢良好的馬鈴薯小苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基,其余的單芽再行繼代培養(yǎng)。1.4葉片的生根培養(yǎng)將苗高2.5～3.5cm,具有2～3片葉的單株轉(zhuǎn)接生根培養(yǎng)基(MS+NAA1.5)中,在培養(yǎng)溫度23±2℃,光照2500Lx,12h/d下進行培養(yǎng)。1.5苗木栽植培養(yǎng)將生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗(4～5片葉,18條左右根)移入常溫室內(nèi)打開瓶蓋放置,3d后從瓶內(nèi)取出幼苗,洗凈根部的培養(yǎng)基,移入盛有栽培基質(zhì)(基質(zhì)配方:砂:腐質(zhì)土:碳渣,1:1:1)的小杯中,每小杯栽1苗,將小杯放入溫室中培養(yǎng)。2結(jié)果與分析2.1,4-d處理分別以莖尖、莖段、芽體做外植體,試驗了不同激素組合對誘導(dǎo)愈傷組織的影響,接種50d的統(tǒng)計結(jié)果見表1。3種外植體在4種培養(yǎng)基中均有愈傷組織產(chǎn)生,但出愈率有明顯差異(在10%～37%之間)。當(dāng)NAA為1.0時,用莖尖和芽體誘導(dǎo),其出愈率分別達10%和20%,莖段沒有愈傷組織形成;配方②、③、④,隨著2,4-D濃度的增加,其誘導(dǎo)能力逐漸增強,出愈率也呈上升趨勢,以④號培養(yǎng)基效果最好,用莖尖、莖段、芽體3種外植體愈傷組織的出愈率保持在33%以上,最高達37%。在②、③、④號培養(yǎng)基中,采用莖段做外植體誘導(dǎo)愈傷組織時,效果較用莖尖和芽體好,其出愈率相對較高。當(dāng)2,4-D濃度為1.5mg/L時,出愈率最高,達到37%。試驗中發(fā)現(xiàn),4種培養(yǎng)基中各外植體的出愈速度和愈傷組織的生長速度都很慢,增長也不明顯,①號培養(yǎng)基用芽體做外植體時最早出現(xiàn)愈傷組織(接種后第10d),②號配方的莖尖,在第20d初見愈傷組織;③號配方莖段和芽體均在第23d左右初見愈傷組織;④號配方的芽體初見愈傷組織的時間最遲(接種后第26d),但該配方上愈傷組織最好,黃白色,顆粒大而疏松(表2)。2.2外植體的誘導(dǎo)結(jié)果將3種外植體分別接入A、B、C培養(yǎng)基上,4d后莖尖和莖段的基部在3種培養(yǎng)基中個別外植體有生長點出現(xiàn),莖段的生長點的膨大速度較快,15d后出現(xiàn)綠色芽體;11d左右莖尖出現(xiàn)明顯的芽體。30d時的誘導(dǎo)結(jié)果見表3。表3顯示,當(dāng)BA濃度一定時,外植體對出芽率的影響表現(xiàn)為:莖尖最高(分別為12%、50%、62%)莖段次之,塊莖最低;當(dāng)采用同種外植體時,不同激素組合對芽分化的影響表現(xiàn)為:處理C效果最好(最高可達62%),B次之,A最差。試驗表明,采用NAA0.2+BA0.3的激素組合,有利于馬鈴薯芽的分化。在此激素水平下,采用莖尖作外植體,其芽的分化率高達62%。因此,本研究的3種培養(yǎng)基中,MS+NAA0.2+BA0.3是最適合誘導(dǎo)馬鈴薯不定芽的培養(yǎng)基配方,莖尖是誘導(dǎo)不定芽的最適外植體。2.3叢生芽總個數(shù)d單芽接種到繼代培養(yǎng)基中第10d即可看見長出的不定芽,16d時叢生芽平均個數(shù)為5個,30d時叢生芽平均個數(shù)增加到8個。芽高保持在0.3～4.8cm之間。不定芽細(xì)長,著生于葉腋處。2.4生根培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的不定芽,接入誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基后15d,小苗基部表面都出現(xiàn)淡黃白色突起,20d后逐漸長成細(xì)長的白色單根。3外植體作誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn),用馬鈴薯的3種外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)時,出愈率普遍偏低,但大部分材料在其底端都以較快的速度長出了大量的不定根。這可能是由于NAA的促根作用和使用濃度偏高;也可能是由于接種時將外植體基部插入培養(yǎng)基中,抑制了愈傷組織的生長,促進了根的形成。研究中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)以莖段作外植體進行芽的誘導(dǎo)時,3種不同培養(yǎng)基都能使莖段底部出現(xiàn)致“瘤”現(xiàn)象,而凡是出現(xiàn)“瘤”的外植體,接入培養(yǎng)基后50d后,均仍無出芽跡象;當(dāng)用莖尖誘導(dǎo)不定芽時,出芽率雖然最高(62%),但誘導(dǎo)出的不定芽白化現(xiàn)象嚴(yán)重,生長受到一定程度的限制。當(dāng)用升汞對塊莖進行表面滅菌時,5min