AFLP實(shí)驗(yàn)操作指南

AFLP試驗(yàn)操作指南試驗(yàn)操作流程DNA樣本的準(zhǔn)備把DNA樣本用紫外光（或熒光）分光光度計(jì)精確的測(cè)取濃度，然后將其稀釋成濃度為50ng/ul，體積為50ul的溶液，假如DNA樣本不多，在保證濃度的狀況下體積可以合適減少。DNA酶切反應(yīng)體系成分體積（ul）雙蒸水11.0緩沖液（Yellowbuffer）4EcoRI(10u/ul)0.3MseⅠ(10u/ul)0.5BSA0.2模板DNA（50ng/ul）4總體積20反應(yīng)程序37℃反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，然后65℃反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，最終保留于檢測(cè)取4－6ul酶切液進(jìn)行酶切效果檢測(cè)，跑出的帶以彌散狀、無(wú)明顯主帶為好。連接接頭接頭的制備按企業(yè)闡明書(shū)將引物單鏈稀釋成高濃度(一般是5OD稀釋成1650ng/ul)溶液儲(chǔ)存于－20℃取部分引物單鏈稀釋成100uM/l，然后兩條正反單鏈混合，體積例如下：10ulEcoR1正鏈、10ulEcoR1反鏈和180ulTE混合成200ulEcoR1接頭；100ulTruI1正鏈、100ulTruI1反鏈混合成200ulTruI1接頭。c、反應(yīng)程序：95℃下5min，65℃下10min，37℃下10min，25℃下10min，保留于4連接反應(yīng)體系成分體積（ul）雙蒸水7.6反應(yīng)緩沖液（T4DNA連接酶自帶）2.5EcoR1接頭1TruI1接頭1T4DNA連接酶（5u/ul）0.4酶切反應(yīng)后溶液12.5總體積25反應(yīng)程序20℃保留過(guò)夜。稀釋按1：10的比列稀釋?zhuān)严♂尩暮臀聪♂尩木砷L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存于－20℃?zhèn)溆?。試?yàn)進(jìn)行到此處可以停止預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系成分體積（ul）雙蒸水9.7緩沖液（10xTag酶自帶）2dNTPs(10Mm0.4EA00(50ng/ul)0.8MC00(50ng/ul)0.8Tag聚合酶（5u/ul）0.1稀釋后已連接DNA模板5MgCl2(25mM1.2總體積20反應(yīng)程序a、94℃b、94℃c、56℃d、72℃e、反復(fù)b～d25次f、72℃g、保留于4稀釋取部分預(yù)擴(kuò)增后溶液按1：25的比列稀釋。將已稀釋的和未稀釋的保留于－20℃儲(chǔ)存。試驗(yàn)進(jìn)行到此處可以停止檢測(cè)取未稀釋的預(yù)擴(kuò)增液4－6ul進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系成分體積（ul）雙蒸水1.55緩沖液（10xTag酶自帶）1dNTPs(10Mm/l0.225EA--(10ng/ul)*2MC--(10ng/ul)*2Tag聚合酶（5u/ul）0.125MgCl2(25mM/l)(Tag酶自帶)0.6預(yù)擴(kuò)增稀釋后模板2.5總體積10*:EA--,MC—背面兩個(gè)堿基因不一樣引物對(duì)而不一樣。（2）反應(yīng)程序a、第1個(gè)循環(huán)：94℃4min,94℃30s,65℃b、第2～13個(gè)循環(huán)：94℃30s,65℃1min,72℃1min（退火溫度每隔一種循環(huán)減少c、第14～36個(gè)循環(huán)：94℃30s,56℃1min,d、72℃5min,46．變性（1）變性劑（Loadingbuffer）配方組分體積去離子甲酰胺（DeionizedFormamide）50mlEDTA(0.5MPH=8.0)1ml二甲苯青FF(XyleneCyanoleFF)0.125g溴酚藍(lán)（BromphenolBlue）0.125g變性將7.5ul變性劑加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物，95℃7.制膠溶液（1）一塊膠的配方將12ml5XTBE和27g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml40％的丙烯酰胺溶液，400ul10%過(guò)硫酸胺（APS）和30ul四甲基一二胺（TEMED）。（2）各組分派方5XTBE：54gTris堿（Tris-base）,27.5g硼酸（B-acid）和20mlEDTA(0.5M,PH=8.0)混合定容至1000ml。40％丙烯酰胺溶液：2g甲叉丙烯酰胺（N、N-MethyleneBisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml。10％過(guò)硫酸胺溶液：1g過(guò)硫酸胺（APS）加水定容至10ml。8.親水和疏水處理及灌膠（1）長(zhǎng)玻璃（親水玻璃）處理：a、親水劑制備：2ml95%酒精，4ul親水硅烷（BindingSilane）,10ul冰醋酸混合。此為一塊板用量。b、洗凈玻璃板，以水沿玻璃板均勻下流為好。c、用手巾紙浸親水劑涂搽玻璃板。d、干燥5分鐘，用約2ml95％的酒精再輕輕涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干約十分鐘。（2）短玻璃（疏水玻璃）處理a、換手套，以防親水劑和疏水劑交叉污染。假如出現(xiàn)污染狀況，可將玻璃浸入10％的NaOH溶液中。b、洗凈玻璃板，以水沿玻璃板均勻下流為好。c、用紙巾浸疏水劑(Repel-silaneES)涂搽玻璃板，要均勻。d、干燥5分鐘，用約2ml95％的酒精再輕輕涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。e、晾干約十分鐘。f、疏水處理做一次大概可以跑5塊膠再做或當(dāng)出現(xiàn)輕微扯膠狀況時(shí)再做。（3）將長(zhǎng)玻璃放在水平的泡沫墊上，親水面向上，將兩個(gè)膠條平行分置于其較長(zhǎng)的兩邊，然后輕輕放上疏水玻璃，疏水面向下。這樣在兩玻璃間形成了一種矩形空隙。用夾子夾住固定。（4）用膠帶將左右兩邊和底邊封上，留出插梳子的邊（有凹邊的那一邊），封時(shí)要均勻不留氣泡。（5）將梳子插入有凹邊的縫隙，看與否輕易均勻，不行要合適調(diào)整。（6）將有凹邊的那邊稍稍墊高，然后配膠用注射器筒灌入，要從一邊均勻灌入，膠中不留氣泡。（7）將梳子平直邊插入凹口縫隙，以形成一種膠的平直端。注意其端線應(yīng)與玻璃板的長(zhǎng)邊垂直。（8）讓膠至少聚合兩個(gè)小時(shí)。9.電泳（1）將電泳槽底盒裝入400ml1XTBE緩沖液，上盒裝入500ml1XTBE緩沖液。（2）輕輕拔掉梳子，固定玻璃于電泳儀上，到入上盒緩沖液，用1000ul槍沖洗凹口縫隙，沖潔凈為好，65W預(yù)電泳30min。（3）預(yù)電泳完畢斷開(kāi)電源，再次沖洗縫隙，然后將梳子齒端插入凹口縫隙，其齒尖端輕輕的插進(jìn)膠中，以構(gòu)成點(diǎn)樣孔。（4）點(diǎn)入3.0～4.5ul變性后的樣品。（5）65W電泳約兩個(gè)半小時(shí)，直到上邊那條淺藍(lán)色的指示帶到離頂端2/3為好。（6）電泳完畢，分開(kāi)兩玻璃板，將固著膠的親水板放入預(yù)先準(zhǔn)備好的10％的醋酸固定液中浸泡固定脫色。10.銀染（1）脫色：2升10％冰醋酸溶液（固定/停止液），輕輕搖20分鐘至所有脫色。附10%冰醋酸配方：200ml冰醋酸與1800ml雙蒸水混合。（2）沖洗：用雙蒸水漂洗三次，每次5分鐘。（3）染色：加染色液，染色20～30分鐘。附染色液配方（用前10分鐘配）：在兩升雙蒸水中加入2gAgNO3，3ml37％甲醛。（4）漂洗：雙蒸水沖洗膠板不超過(guò)5秒鐘。（5）顯影：在2升冷卻的顯影液中輕輕的搖動(dòng)，直至帶紋的出現(xiàn)。附顯影液配方：在2升雙蒸水中加入60gNaCO3，完全溶解后放入4℃冰箱冷卻至4℃（6）定影：加入等體積的固定/停止液（即脫色中所用的），固定2分鐘。（7）沖洗：用雙蒸水沖洗2次，每次2分鐘。（8）膠的干燥：室溫下自然干燥。附表：接頭和引物序列編碼接頭和引物序列Ead55-CTCGTAGACTGCGTACCEad35-AATTGGTACGCAGTCTACMad55-GACGATGAGTCCTGAGMad35-TACTCAGGACTCATEA005-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3MC005-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3EA015-GACTGCGTACCAATTCATC-3EA025-GACTGCGTACCAATTCAGA-3EA035-GACTGCGTACCAATTCACG-3EA045-GACTGCGTACCAATTCATG-3EA055-GACTGCGTACCAATTCAAG-3EA065-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E015-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E025-GACTGCGTACCAATTCACC-3E035-GACTGCGTACCAATTCACA-3E045-GACTGCGTACCAATTCACT-3E055-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E065-GACTGCGTACCAATTCAGT-3E075-GACTGCGTACCAATTCAG-3MC015-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3MC025-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3MC035-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3MC045-GATGA