1株去氫表雄酮-三羥基雄甾烯酮的誘變選育

1株去氫表雄酮-三羥基雄甾烯酮的誘變選育

三羥基雄烯酮（7'，15'，二羥基二醇）是合成化療抗癲癇藥物的重要中心。Yasmin是最早由先靈公司開(kāi)發(fā)成功的口服避孕藥。生物轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是解決甾體非活性碳原子特異性氧化的最有效方法。微生物能在甾體母核或側(cè)鏈基團(tuán)上特異性地加入一個(gè)或兩個(gè)羥基,甾體的羥基化是合成具有生物活性甾體衍生物的最重要方法之一。利用微生物的P450羥化酶系統(tǒng)能將去氫表雄酮(DHEA)雙羥基化合成7α,15α-diOH-DHEA。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,絲狀真菌具有將DHEA轉(zhuǎn)化為7α,15α-diOH-DHEA的能力,例如尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumVKMF-1600和亞麻刺盤(pán)孢Colletotrichumlini。當(dāng)DHEA的濃度為2g/L時(shí),尖孢鐮刀菌的7α,15α-diOH-DHEA摩爾得率達(dá)到63%。雖然Romano等發(fā)現(xiàn)亞麻刺盤(pán)孢的DHEA濃度為2.5g/L時(shí),7α,15α-diOH-DHEA的摩爾得率提高到69.8%。但仍然存在底物投料濃度低、產(chǎn)物得率不高的問(wèn)題,必將限制著7α,15α-diOH-DHEA的工業(yè)化應(yīng)用。因此有必要對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行選育和工藝優(yōu)化,從而進(jìn)一步提高甾體DHEA的轉(zhuǎn)化效率。目前在高效菌株的選育中,誘變育種是普遍應(yīng)用并十分有效的方法,但由于甾體類(lèi)轉(zhuǎn)化的微生物大多數(shù)為霉菌,采用傳統(tǒng)的菌絲體誘變方法較難達(dá)到預(yù)定的誘變效果。因此,在了解菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上,采用單孢子或原生質(zhì)體誘變并結(jié)合特定的篩選方法選擇效果最佳。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到一株將DHEA轉(zhuǎn)化為7α,15α-diOH-DHEA的赤霉菌GibberellaintermediaCA3-1,但其DHEA的轉(zhuǎn)化能力仍然不高。本文采用亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變結(jié)合酮康唑篩選方法對(duì)赤霉菌孢子進(jìn)行誘變,提高篩選效率,并對(duì)高效突變菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化,從而進(jìn)一步提高突變菌的轉(zhuǎn)化效率。1材料和方法1.1蘑菇赤霉菌(G.intermediaCA3-1),由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。1.2kh2po2斜面固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉7.5,NaCl1.16,KH2PO42.72,瓊脂2%,自然pH。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉7.5,NaCl1.16,KH2PO42.72,自然pH。原始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉15,玉米漿6,初始pH7.0。1.3式搖床培養(yǎng)將種子液按6%接種量轉(zhuǎn)接到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,組合式搖床220r/min、28℃培養(yǎng)24h。向已培養(yǎng)24h轉(zhuǎn)化液中投入5g/LDHEA,繼續(xù)轉(zhuǎn)化72h。1.4誘導(dǎo)突變育種1.4.1子懸液的制備按照參考文獻(xiàn)制備孢子懸液,最終孢子懸液的濃度為1×106個(gè)/mL左右。1.4.2強(qiáng)制變?cè)u(píng)價(jià)模型的構(gòu)建按照盧文玉等報(bào)道的方法確定酮康唑?qū)Τ嗝咕淖钚∫种茲舛取?.4.3鹽水液混合均調(diào)液ld50將NTG分別用孢子懸液稀釋到濃度0.12mg/mL,混合均勻并處理30min時(shí)間后,用生理鹽水稀釋10–5倍。分別吸取100μL稀釋液并涂布在酮康唑抗性篩選平板上,定時(shí)觀(guān)察并計(jì)數(shù)。1.4.4初篩和復(fù)篩挑取篩選平板中長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落,轉(zhuǎn)接到平板中分離活化,進(jìn)行平板初篩;繼而接種于搖瓶初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,進(jìn)行復(fù)篩。對(duì)轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)菌株進(jìn)行反復(fù)篩選,篩選得到穩(wěn)定的高效突變菌株。1.5分析1.5.1生物量的測(cè)量將轉(zhuǎn)化液離心去上清得菌絲體,用去離子水重復(fù)洗滌2~3次,105℃烘箱烘干至恒重。1.5.2色譜柱及色譜柱按照參考文獻(xiàn)制備高效液相色譜樣品。HPLC條件采用AgilentTC-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈/水(7:3,V/V);柱溫:30℃,檢測(cè)波長(zhǎng):206nm,流速:0.5mL/min,進(jìn)樣量10μL。1.6培養(yǎng)基培養(yǎng)基的添加量:碳源、氮源、教學(xué)物質(zhì)中添加合適濃度的無(wú)機(jī)溶劑濃度對(duì)產(chǎn)物濃度的影響,未充培養(yǎng)基組分的優(yōu)化:以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,采用單因素優(yōu)化方法,保持其他成分濃度不變,僅改變碳源、氮源的濃度及添加適宜濃度的無(wú)機(jī)鹽,考察其對(duì)產(chǎn)物濃度的影響,獲得最佳培養(yǎng)基。pH的優(yōu)化:分別調(diào)配不同初始pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的培養(yǎng)基,考察初始pH對(duì)產(chǎn)物合成的影響,以確定最適初始pH值。2結(jié)果與分析2.1氧或底物抑制酮康唑?yàn)橐环N細(xì)胞色素P450抑制劑,是血紅素的配體,能與P450競(jìng)爭(zhēng)分子氧或底物抑制P450酶活。能耐受酮康唑最低抑制濃度的菌株,即可能是P450羥化酶活性提高的突變菌株。表1顯示,在酮康唑濃度為350~360μmol/L之間對(duì)菌體的抑制作用較明顯,因此酮康唑最低抑制濃度為350μmol/L。2.2突變菌株與出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)化能力根據(jù)上述條件,對(duì)赤霉菌孢子進(jìn)行NTG誘變處理。在酮康唑篩選平板分離到102株抗性菌株,通過(guò)搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)其7α,15α-diOH-DHEA的濃度,其中有10株產(chǎn)物得率高于出發(fā)菌株,結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,突變菌株M-10轉(zhuǎn)化能力高于出發(fā)菌株,產(chǎn)物摩爾得率從57.6%分別提高到70.2%,為出發(fā)菌株的1.2倍。選取M-10進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),在斜面培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接5代,其7α,15α-diOH-DHEA的得率均未發(fā)生明顯變化,說(shuō)明該突變菌株遺傳特性穩(wěn)定。2.3葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)物合成的影響以葡萄糖為碳源,研究不同葡萄糖濃度(5、10、15、20、25和30g/L)對(duì)產(chǎn)物合成的影響,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)葡萄糖濃度在15g/L的時(shí)候,產(chǎn)物得率最高為72.2%。因此碳源選擇15g/L的葡萄糖。2.4組合濃度對(duì)m-10菌株轉(zhuǎn)化dhea的影響以酵母粉和玉米漿為復(fù)合氮源,探討不同復(fù)合氮源酵母粉和玉米漿組合濃度對(duì)M-10菌株轉(zhuǎn)化DHEA生成7α,15α-diOH-DHEA的影響,結(jié)果如表3所示。當(dāng)復(fù)合氮源酵母粉濃度在16g/L,玉米漿濃度為8g/L時(shí),產(chǎn)物得率最高。2.5無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株m-10的影響無(wú)機(jī)鹽是微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分,參與并維持生物體的代謝活動(dòng)、維持生物體內(nèi)的酸堿平衡和維持細(xì)胞的滲透壓等。考察了不同種類(lèi)的無(wú)機(jī)鹽對(duì)突變菌株M-10生成7α,15α-diOH-DHEA的影響(圖2)。結(jié)果表明當(dāng)添加0.1g/L的MgSO4時(shí),7α,15α-diOH-DHEA得率有所提高。2.6初始ph對(duì)15-dioh-dhea表達(dá)的影響研究了不同初始pH對(duì)突變株M-10轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的影響(圖3),結(jié)果表明當(dāng)初始pH為6.5時(shí),7α,15α-diOH-DHEA產(chǎn)物得率最高。2.7突變菌株的轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)在已確定的最適轉(zhuǎn)化條件下:葡萄糖15g/L,酵母粉16g/L,玉米漿8g/L,MgSO40.1g/L,初始pH6.5,突變菌株M-10的轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)如圖4所示。采用最優(yōu)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h之后投入5g/L底物DHEA,轉(zhuǎn)化至96h時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到(4.2±0.15)g/L,摩爾產(chǎn)物得率提高到75.6%,較原始菌株提高了31.3%。3突變株的生產(chǎn)和投料量的提高以G.intermediaCA3-1為出發(fā)菌株,經(jīng)NTG誘變結(jié)合酮康唑抗性平板篩選,獲得一株高效轉(zhuǎn)化D