分子克隆載體課件

分子克隆載體分子克隆載體1基因工程的表達(dá)體系操縱子理論在基因工程中的應(yīng)用目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性常用基因載體基因工程的表達(dá)體系2基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA3分子克隆載體課件4

基因工程的表達(dá)體系

5原核生物表達(dá)體系：

大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌原核生物表達(dá)體系：6大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：積累了充足經(jīng)驗(yàn)，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對(duì)低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克隆（subclone），然后采用其它方式轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞上表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：7缺點(diǎn)：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；常會(huì)形成包涵體。分子克隆載體課件8

表達(dá)體系的發(fā)展

表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個(gè)體

9

基因工程的目的是使目的基因能高效表達(dá)。基因表達(dá)受DNA結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)因子與核酸相互辨認(rèn)、結(jié)合等組成的表達(dá)體系的調(diào)控。

基因表達(dá)調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進(jìn)行基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識(shí)，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造?；蚬こ痰哪康氖鞘鼓康幕蚰芨咝П磉_(dá)。10

操縱子理論在基因工程的應(yīng)用

11一、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原核生物的轉(zhuǎn)錄單位是操縱子，操縱子包括相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列一、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原核生物的轉(zhuǎn)錄單位是操縱子，操縱子包12操縱子P：?jiǎn)?dòng)序列O：操縱序列I：調(diào)節(jié)序列

I

POCAP調(diào)控區(qū)

ZYX結(jié)構(gòu)基因以乳糖操縱子（lacoperon）為例：操縱子P：?jiǎn)?dòng)序列O：操縱序列13誘導(dǎo)物

ZYX

I

POCAP

ZYX

I

POCAP誘導(dǎo)物ZYXI14二、強(qiáng)啟動(dòng)子的構(gòu)建二、強(qiáng)啟動(dòng)子的構(gòu)建15ZYX侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。3’…ACACUAGG…5’16sRNA含有串聯(lián)的來自λ噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)PL及PR，啟動(dòng)子的串聯(lián)可能有相互增強(qiáng)作用。含有λCIts857組件，此組件可變溫誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。ZYX四、轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)的插入λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）?？梢虿煌d體而選擇不同菌種作宿主；原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；真核生物啟動(dòng)子保守序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)（S-D序列）它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。Ptac17TTGACATATAAT基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。一種以pBR322為基礎(chǔ)的酵母質(zhì)粒，兩個(gè)抗藥基因及左下方的半圓來自pBR322，右上半圓來自酵母，包括啟動(dòng)子、糖代謝酶類及氯霉素抗性基因，可在大腸桿菌體系重組再轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞稱為穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；5’…ATGNATGNATGZ123456保證正確閱讀AUG的序列ATGNATGNATG，（LacZ基因N端序列）開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動(dòng)子保守序列RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3

3

ZYX開始轉(zhuǎn)錄TTG16RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTT17TATA盒CAAT盒GC盒

增強(qiáng)子

順式作用元件結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始真核生物啟動(dòng)子保守序列TATA盒CAAT盒GC盒增強(qiáng)子順式作用元件結(jié)18RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合19Ptac啟動(dòng)子Ptrp與Plac的雜化產(chǎn)物Ptac比原來各自的活性強(qiáng)

-35區(qū)-10區(qū)Ptrp

TTGACATTAACT

共有序列

TTGACATATAAT

Ptac17

TTGACATATAAT

Ptac啟動(dòng)子20分子克隆載體課件21乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖

乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。

IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。LacZ基因編碼的乳糖苷酶

X-gal

藍(lán)色吲哚產(chǎn)物三、藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal試驗(yàn)）乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖三、藍(lán)白斑22誘導(dǎo)物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖誘導(dǎo)物ZYXPO23標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZ標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH24X-galLacZ藍(lán)色化合物X-galX-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal25（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）Lac26轉(zhuǎn)錄終止：非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止需要莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以t（termination）代表。CGGCCGCGGCCUAAUGA5’…AUACCAUUUUUUUUU…3’四、轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)的插入轉(zhuǎn)錄終止：非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止需要莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以t（term27莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG53

35RNA-pol莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；5′28把λ啟動(dòng)子連同其附屬成分，置換了pBR322的tetr基因，成為以λ啟動(dòng)子為組件的質(zhì)粒。TATAATPuATATTAPyZYX第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌Ptrp與Plac的雜化產(chǎn)物Ptac比原來各自的活性強(qiáng)CGGCCGCGGCIV含有串聯(lián)的來自λ噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)PL及PR，啟動(dòng)子的串聯(lián)可能有相互增強(qiáng)作用。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，猿猴病毒SV40的組件等。如攜帶殺蟲基因的病毒對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行生物防治。如果插入序列自身不含ATG起始密碼,或限制酶切點(diǎn)不能把讀碼框準(zhǔn)確置于ATG之后,或插入片段編碼未清楚,可在目的基因之前設(shè)保險(xiǎn)序列:原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；基因載體是一類能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性基因工程載體的構(gòu)建必需應(yīng)用表達(dá)調(diào)控的基本理論知識(shí)，應(yīng)用已知的調(diào)控序列進(jìn)行重組、改造。λ噬菌體的生活周期：如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，猿猴病毒SV40的組件等。侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。分離得到某些λ噬菌體，在低溫時(shí)（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動(dòng)子。

五、增強(qiáng)子

轉(zhuǎn)錄起始前-30區(qū)為TATA盒，還有多種順式作用組件相互配搭成啟動(dòng)子。

增強(qiáng)子遠(yuǎn)距離地、不同方向地控制啟動(dòng)子的活性。增強(qiáng)子的核心序列是TGTGGAATTAG。增強(qiáng)子的作用特點(diǎn)有：非特異性遠(yuǎn)距離操縱、多方向性。

酵母結(jié)構(gòu)基因的上游還有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。把λ啟動(dòng)子連同其附屬成分，置換了pBR322的tetr基因，29目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性目的基因翻譯表達(dá)及其準(zhǔn)確性30核糖體結(jié)合位點(diǎn)（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA結(jié)合的位點(diǎn)S-D序列(Shine-Dalgarno)，又稱為核糖體結(jié)合點(diǎn)。

3’…ACACUAGG…5’16sRNA

UCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7個(gè)Pu是核糖體小亞基的辨認(rèn)部位核糖體結(jié)合位點(diǎn)（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA31lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTPlF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF32分子克隆載體課件33基因克隆時(shí)的定向插入

插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會(huì)倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正確轉(zhuǎn)錄，這種構(gòu)建方式稱為定向插入?；蚩寺r(shí)的定向插入插入序列兩邊的酶切口不同,插入的34EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC19EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC135如果插入序列自身不含ATG起始密碼,或限制酶切點(diǎn)不能把讀碼框準(zhǔn)確置于ATG之后,或插入片段編碼未清楚,可在目的基因之前設(shè)保險(xiǎn)序列:

5’…ATGNATGNATG5’…ATGNATGNATG1234565’…ATGNATGNATGXY1234565’…ATGNATGNATGZ123456能正確讀出三聯(lián)體密碼的起始序列如果插入序列自身不含ATG起始密碼,或限制酶切點(diǎn)不能36TAAATGIIIIIIIVVIVIIIVATGIIIIIIVIIIIIIOri轉(zhuǎn)錄起始翻譯起始信號(hào)肽成熟蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)CSCSCSCS--cloningsiteTAAATGIIII37常規(guī)質(zhì)粒載體常規(guī)質(zhì)粒載體38質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

Plasmidchromosome

質(zhì)粒(plasmid)

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體39第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。Gal+ATPGal-1-P+ADP6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，猿猴病毒SV40的組件等。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。原核生物的轉(zhuǎn)錄單位是操縱子，操縱子包括相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。λ噬菌體可以容納較大的目的基因。（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；pBV221分子量小，易轉(zhuǎn)化，操縱子理論在基因工程中的應(yīng)用如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，猿猴病毒SV40的組件等。ZYXRNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)AGGA后的的7個(gè)Pu是核糖體小亞基的辨認(rèn)部位原核生物啟動(dòng)子保守序列基因載體應(yīng)具備的條件：（1）有多種限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，但每種切口最好只有1個(gè)；（2）有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗(yàn)；（3）有一定容量；（4）有相當(dāng)?shù)某緮?shù)，即每個(gè)宿主菌可能容納的最多數(shù)。第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵40多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker411、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。4、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。質(zhì)粒的生物學(xué)特性1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。質(zhì)粒的425、根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個(gè)）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。5、根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制43

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

發(fā)展概況

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如44分子克隆載體課件45

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。

pBR322pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序46有過百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)也多達(dá)數(shù)十個(gè)，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。此外，pBR322DNA，被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有過百個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點(diǎn)47普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖48抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗藥性標(biāo)志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板T49分子克隆載體課件50分子克隆載體課件51pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ不得基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker.

pUC質(zhì)粒系列pUC質(zhì)粒系列也是在pBR322基礎(chǔ)上改52476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，表達(dá)半乳糖苷酶的α片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動(dòng)子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)是M13的多功能連接器。476bp片段含有E.coli的lacZ基因的5’-序列，53三個(gè)顯著特點(diǎn)：（1）分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。（2）含易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測(cè)序和體外突變等研究。三個(gè)顯著特點(diǎn)：54pKO系列組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位點(diǎn)包括terr，.表達(dá)產(chǎn)物催化Gal+ATPGal-1-P+ADP以14C標(biāo)記的半乳糖作底物,檢測(cè)生成的*Gal-1-P的放射性。pKO系列組成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR32255在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算啟動(dòng)子功能的強(qiáng)弱。如在Galk基因前插入目的基因，與無插入的空載pKO比較，并無放射活性的增強(qiáng)，則說明插入片段不存在有啟動(dòng)子。在Galk基因上游插入目的基因，根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物半乳糖56λ噬菌體載體λ噬菌體載體57噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一58侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原兩種生活方式生存和繁殖（圖1-5）。圖左示λ噬菌體在宿主內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，在1個(gè)菌體內(nèi)生長出100個(gè)左右的新噬菌體，并沖破（殺死）細(xì)菌釋放出來，再度感染其它活菌，稱為裂解。λ噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）。侵犯細(xì)菌時(shí)，只是DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來復(fù)制、轉(zhuǎn)錄59λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細(xì)菌-獨(dú)立復(fù)制-裂解（沖破細(xì)胞膜）-再感染其他細(xì)菌。λ噬菌體的生活周期：60分子克隆載體課件61λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和用途λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個(gè)基因。λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和用途λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端62λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：

結(jié)構(gòu)區(qū)A～J19個(gè)基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子、終止子和N、CI基因，O-R為裂解區(qū).

λ噬菌體基因大致分為4個(gè)區(qū)：63λ噬菌體及其組件的應(yīng)用

λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達(dá)20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因。

基因文庫構(gòu)建常使用λ載體；不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進(jìn)行構(gòu)建。λ噬菌體及其組件的應(yīng)用λ噬菌體可以容納較大的目的基因64λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素可能很多，實(shí)驗(yàn)室常用的是熱誘導(dǎo):分離得到某些λ噬菌體，在低溫時(shí)（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。λclts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達(dá)，30℃不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。λCIts857λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。λCIts65ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培養(yǎng)：ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培養(yǎng)：66目的基因阻遏蛋白42℃下培養(yǎng)：失活目的基因阻遏蛋白42℃下培養(yǎng)：失活67λPL和λPR

λPL和PR

是λ噬菌體上2個(gè)主要的啟動(dòng)子，都是啟動(dòng)能力相當(dāng)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄構(gòu)件。把λ啟動(dòng)子連同其附屬成分，置換了pBR322的tetr基因，成為以λ啟動(dòng)子為組件的質(zhì)粒。λPL和λPRλPL和PR是λ噬菌體上2個(gè)主要的啟動(dòng)68（1）粘粒（cosmid）能容納大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）載體。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的λcos位點(diǎn)。構(gòu)建基因文庫的λ載體（1）粘粒（cosmid）構(gòu)建基因文庫的λ載體69（2）λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉(zhuǎn)染效率的有效方法在A蛋白（有終止