阿司匹林丁香酚酯抗炎作用及其機(jī)制研究

阿司匹林丁香酚酯抗炎作用及其機(jī)制研究

近年來(lái)，從解熱鎮(zhèn)痛到抗炎、抗風(fēng)濕、抗血小板聚集和抗癌的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛和重要，但長(zhǎng)期使用對(duì)胃腸損傷的損害也越來(lái)越明顯。因此,為了消除其不良反應(yīng),避免阿司匹林中羧基對(duì)胃腸道的刺激,減輕該藥對(duì)胃腸道的直接損傷,筆者將阿司匹林的游離羧基與丁香酚(eugenol)結(jié)合,屏蔽了游離羧基,形成一種新的酯類化合物——阿司匹林丁香酚酯(aspirineugenolester,AEE),理論上該化合物具有明顯的優(yōu)勢(shì),可降低阿司匹林的酸性對(duì)胃腸的不良反應(yīng),以及丁香酚的刺激性和易氧化性,同時(shí)未改變發(fā)揮臨床作用的結(jié)構(gòu)部位。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)大鼠解剖未見胃腸道出血和潰瘍等不良反應(yīng),AEE的LD50為10.39g·kg-1,阿司匹林的LD50為1.5g·kg-1,丁香酚的LD50為2.68g·kg-1,AEE較兩種前體藥具有明顯的低毒優(yōu)勢(shì),提示AEE已達(dá)到降低毒性的目的。為了研究AEE是否具有2種前體藥的藥效,本研究觀察了AEE的抗炎作用,并初步探討其可能的作用機(jī)制,以期為AEE的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1小鼠足跖水腫實(shí)驗(yàn)1.1動(dòng)物、藥品、試劑和儀器昆明種小鼠,雌雄兼用,體質(zhì)量18~22g,由蘭州大學(xué)提供。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度18~25℃,濕度50%~60%。AEE:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備,HPLC法測(cè)定其純度>99%;丁香酚:江西匯通藥用香料油有限公司,純度>99%;阿司匹林:武漢合中化工制造有限公司,純度>99.9%。二甲苯等化學(xué)試劑:國(guó)產(chǎn),分析純。721紫外分光光度計(jì):上海分析儀器廠;LS55型熒光分光光度計(jì):PerkinElmer公司。1.2阿司匹林丁香酚酯、阿司匹林和丁香酚混懸液的制備實(shí)驗(yàn)前用濃度0.5%的羧甲纖維素鈉溶液配制AEE5和10g·L-1混懸液及阿司匹林10g·L-1的混懸液;將丁香酚與吐溫80以2∶1比例混合,加入一定量生理鹽水,配制成8g·L-1的混懸液,在漩渦振蕩器上充分混勻后密封保存。1.3二甲苯致小鼠耳腫脹測(cè)定小鼠50只,隨機(jī)平均分為5組:模型組(灌服0.5%的羧甲纖維素鈉)、阿司匹林0.2g·kg-1組、丁香酚0.18g·kg-1組、AEE0.18和0.36g·kg-1組,小鼠ig給予相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)3d。于末次給藥1h后麻醉,二甲苯50μl涂于小鼠右耳郭兩面,60min后處死小鼠,用打孔器打下雙耳同一部位耳片稱重,計(jì)算耳郭的腫脹度和腫脹抑制率。腫脹度=右耳片重量-左耳片重量;腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。1.4小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性測(cè)定小鼠50只,給藥處理同1.3。末次給藥1h后尾靜脈注射0.5%依文思藍(lán)生理鹽水溶液10ml·kg-1,同時(shí)ip給予0.6%醋酸10ml·kg-1。1h后處死,用6ml生理鹽水反復(fù)沖洗腹腔,收集沖洗液并稀釋至10ml。1000×g離心15min,取上清液于紫外分光光度計(jì)590nm處測(cè)定A590nm,以A590nm反映毛細(xì)血管的通透性。1.5角叉菜膠致小鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)小鼠180只,隨機(jī)平均分為6組:正常組及模型組(灌服0.5%的羧甲纖維素鈉20ml·kg-1)、阿司匹林0.2g·kg-1組、丁香酚0.18g·kg-1組、AEE0.18和0.36g·kg-1組,給藥處理同1.3。末次給藥后1h,除正常對(duì)照組外其他所有小鼠右后足跖皮內(nèi)注射1%角叉菜膠0.03ml,4h后脫頸椎處死小鼠,沿踝關(guān)節(jié)上的標(biāo)記線剪下左右后足,以左右后足重量差為足腫脹度,計(jì)算腫脹抑制率:腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。1.6小鼠棉球肉芽腫的檢測(cè)小鼠50只,分組同1.3。在無(wú)菌條件下,于小鼠腋窩部皮下手術(shù)植入一個(gè)(10±1)(x±s)mg的滅菌青霉素棉球,術(shù)后每天ig給藥1次,連續(xù)7d。7d后處死小鼠,剝離棉球,60℃烘箱內(nèi)烘干稱重,計(jì)算小鼠平均每10g體質(zhì)量增生的肉芽腫質(zhì)量(mg)。1.7角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)含量的測(cè)定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別浸入盛有2.5ml生理鹽水的試管中,振搖2h后取出,將浸泡液1000×g離心15min,取上清液0.3ml于另一試管內(nèi),加入0.5mol·L-1KOH甲醇溶液1.0ml,50℃水浴20min異構(gòu)化,加甲醇2.5ml,測(cè)定A278nm值,用A278nm值表示PGE2含量。1.8角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測(cè)定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別置于0.45ml20%的三氯醋酸中浸泡4h后棄炎足,在浸泡液中加入0.55mlTBA液(含1%硫代巴比妥酸的鹽酸0.1mol·L-1)混勻,90~95℃水浴15min后加2ml生理鹽水稀釋,1000×g離心5min,取上清液于532nm處測(cè)定A532nm,用標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算MDA含量。1.9角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠血清中一氧化氮(nitricoxide,NO)含量的測(cè)定將對(duì)氨基苯磺酰胺溶于5%的磷酸中,配制成濃度為1%的對(duì)氨基苯磺酰胺溶液100ml,另配置0.1%的鹽酸萘乙二胺水溶液100ml,將上述2種溶液等體積混合后即為Griess試劑,4℃保存。取1.4處理小鼠,每組10只,眼眶采血,離心,分離血清100μl,加入等體積Griess試劑,室溫反應(yīng)10min,于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度(A550nm)值,以A550nm表示NO含量。1.10角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量的測(cè)定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別浸泡于4.0ml酸化正丁醇中4h,超聲處理20min,棄足離心,取上清液2.5ml,加入正庚烷3ml和0.1mol·L-1的鹽酸1.2ml振蕩5min,離心棄去有機(jī)相,取水相0.5ml,加入0.1ml0.5%半胱氨酸、0.04%鄰苯二甲醛3ml和0.02%NaIO40.1ml后沸水浴10min,用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm,熒光波長(zhǎng)480nm處,測(cè)定熒光強(qiáng)度(intenseoffluorescence,IF),表示5-HT的含量。2結(jié)果2.1對(duì)二甲苯所致的耳郭水腫的影響由表1結(jié)果可見,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1均能顯著抑制二甲苯所致的耳郭腫脹(P<0.05,P<0.01),其抑制作用與阿司匹林相當(dāng),但強(qiáng)于丁香酚。2.2aee對(duì)小鼠臟器結(jié)構(gòu)的影響表2結(jié)果顯示,與模型組比較,各給藥組伊文思藍(lán)的滲出均明顯減少,表明AEE0.18和0.36g·kg-1能顯著降低腹腔毛細(xì)血管通透性(P<0.05,P<0.01),與阿司匹林效果相當(dāng),丁香酚作用不顯著。2.3阿司匹林丁香酚酯對(duì)大鼠棉球腫脹的影響表3結(jié)果表明,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1均能抑制棉球肉芽組織增生,與阿司匹林和丁香酚作用相似。2.4小鼠急性足跖水腫與模型組比較,AEE0.18g·kg-1組與阿司匹林均能顯著抑制角叉菜膠所致的小鼠急性足跖腫脹(P<0.05,P<0.01);丁香酚抑制作用不明顯(表4)。2.5aee對(duì)炎癥組織及血清中相關(guān)指標(biāo)的影響表5結(jié)果表明,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1可明顯減少炎癥組織中PGE2含量(P<0.05,P<0.01),作用與阿司匹林和丁香酚相當(dāng)。AEE0.18g·kg-1可減少炎癥組織中5-HT含量,與阿司匹林和丁香酚作用相似。AEE0.18和0.36g·kg-1對(duì)炎癥組織中MDA含量無(wú)明顯影響,阿司匹林和丁香酚可明顯降低炎癥組織中MDA含量(P<0.05,P<0.01)。AEE0.36g·kg-1可減少角叉菜膠致足跖腫脹小鼠血清中NO含量(P<0.05),與阿司匹林作用相似;AEE0.18g·kg-1和丁香酚對(duì)血清中NO含量無(wú)明顯影響。3從足跖水腫模型及抗炎藥物的抗炎作用炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)局部損傷的反應(yīng),可概括分為早、中、晚三期,早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫;中期主要是白細(xì)胞向炎灶聚集;晚期則以炎灶屏障形成和組織增生為特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用各種急性和慢性炎癥模型觀察AEE的抗炎作用,二甲苯涂于小鼠耳部,使局部組織損傷,引起局部毛細(xì)血管通透性增加,某些炎癥介質(zhì)如組胺、蛋白溶解酶釋放,導(dǎo)致滲出性炎性水腫;染料依文思藍(lán)與血漿蛋白結(jié)合,當(dāng)致炎因子誘導(dǎo)毛細(xì)血管通透性增高時(shí),在一定范圍內(nèi)染料的滲出量可反映毛細(xì)血管滲出的血漿蛋白量;注射角叉菜膠誘發(fā)小鼠足跖腫脹模型是模擬炎癥腫脹的病理變化,這種方法也是目前常用的炎癥水腫模型,其特點(diǎn)是致炎局部白細(xì)胞浸潤(rùn),PGE2合成增加以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活,初期的水腫(致炎后lh內(nèi))主要由組胺和5-HT釋放所致,致炎后3h時(shí)水腫主要由PGE2介導(dǎo),兩期之間的水腫主要是由激肽類物質(zhì)維持;作為篩選抑制炎癥增殖期藥物的模型,棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)屬于增生性炎癥實(shí)驗(yàn),棉球埋入小鼠局部皮下后可產(chǎn)生與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生,棉球誘導(dǎo)的小鼠肉芽腫模型造成的病理變化符合慢性炎癥模型。本研究結(jié)果顯示,AEE可以明顯抑制急性期毛細(xì)血管擴(kuò)張及滲出、炎癥中期炎性水腫、慢性肉芽腫,表明AEE具有明顯的抗炎作用,與前體藥阿司匹林和丁香酚的抗炎作用相當(dāng)。本研究結(jié)果表明,AEE與阿司匹林和丁香酚相似,可抑制環(huán)氧酶途徑的某個(gè)環(huán)節(jié),減少炎性介質(zhì)PGE2含量,同時(shí)亦可減少5-HT的含量;但AEE對(duì)炎癥組織中MDA含量無(wú)影響,