木霉制劑對土壤定殖動態(tài)及微生物數(shù)量的影響

木霉制劑對土壤定殖動態(tài)及微生物數(shù)量的影響

香蕉萎縮，也稱為棕櫚樹病和黃葉病，是由頭孢菌c.c.c.感染引起的。這是土壤傳播的一種毀滅性疾病。近年來在海南、廣東、廣西等香蕉主產(chǎn)區(qū)枯萎病的發(fā)生日趨嚴重。目前單純采用化學(xué)藥劑防治香蕉枯萎病的效果并不理想,農(nóng)藥的過量使用還會造成土壤中農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染,影響土壤質(zhì)量,導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡。因此利用木霉(Triochodermaspp.)等生防菌防治香蕉枯萎病的生物防治技術(shù)逐步受到重視。然而木霉等生防菌在土壤中的定殖過程容易受到諸多自然因素的影響,因此,多數(shù)木霉制劑的研究仍停留在實驗室階段。本試驗初步研究了木霉在土壤中的動態(tài)變化以及木霉制劑對土壤微生物數(shù)量的影響,為木霉制劑的田間應(yīng)用和香蕉枯萎病的生物防治提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1培養(yǎng)基na培養(yǎng)基:真菌分離用孟加拉紅培養(yǎng)基,配方為:葡萄糖10g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,孟加拉紅0.033g,0.1g氯霉素,瓊脂15g,水1L。細菌分離用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA),配方為:牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂15g,水1L,pH7.0。木霉制劑:特克德菌木霉菌粉劑(臺灣地球村生態(tài)有限公司生產(chǎn));自制木霉菌劑為作者篩選的9株木霉菌株,經(jīng)木薯渣發(fā)酵配制而成(孢子濃度為107CFU/g)。土壤消毒劑:50%氰氨化鈣顆粒劑(榮寶牌,寧夏大榮實業(yè)有限公司生產(chǎn))。1.2香蕉根圍土樣的采集試驗在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所玻璃溫室內(nèi)進行。從南寧市武鳴縣香蕉種植園隨機采回耕作層土壤,混勻后分成2份,其中1份經(jīng)高壓滅菌(121℃,0.1MPa,60min)后裝盆(盆高22cm,直徑20cm),另一份為自然土壤作對照。每盆施入150g自制木霉菌劑,與盆中土壤混勻,然后移栽1株葉片數(shù)為5～6張、長勢一致的脫毒組培蕉苗。每隔2～3d淋水1次,保持土壤濕度,每個處理設(shè)3次重復(fù)。處理7d后進行香蕉根圍土樣的第1次采集,之后各處理每隔7d采集1次土樣,共采集9次。稱取10g土樣至裝有90mL無菌水的滅菌三角瓶中,在渦旋器上充分震蕩1min,制成土壤懸浮液,做10倍濃度梯度稀釋至10-4,用微量移液器從10-2、10-3、10-4稀釋液中各取0.1mL,分別涂布至孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,28℃下倒置培養(yǎng)。36h后,對平皿上直徑5mm左右的白色單菌落進行計數(shù),計算土樣中木霉數(shù)量。每克土樣含菌數(shù)量(CFU/g)=單菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)1.3蕉苗和蕉苗處理田間試驗在廣西武鳴縣鑼圩鎮(zhèn)那則村培聯(lián)屯進行,該地長年種植西貢蕉,歷年枯萎病發(fā)生嚴重。試驗區(qū)香蕉種植株行距為2.81m×2.93m,每公頃植1425株,共設(shè)置3個處理:Ⅰ,自制木霉菌劑;Ⅱ,特克德菌木霉菌粉劑;Ⅲ,CK。蕉苗移栽前,2012年6月5日,處理區(qū)Ⅰ和處理區(qū)Ⅱ用50%氰氨化鈣顆粒劑對土壤進行消毒處理,用量為每公頃900kg,隨后用地膜覆蓋。6月29日揭膜移栽蕉苗,并進行第1次菌劑處理。處理Ⅰ每株蕉苗根圍施入3kg自制木霉菌劑,處理Ⅱ每株蕉苗根圍施入與處理Ⅰ含有相同當量孢子的特克德菌木霉菌粉劑,培土覆蓋,適當淋水定殖,CK不進行土壤消毒也不施木霉制劑作為對照,分別于8月21日和10月23日進行第2次和第3次處理,方法同第1次。以上每處理3次重復(fù)。1.4細菌、真菌數(shù)量測定分別于2012年6月29日、8月21日和10月23日當天菌劑處理之前,在香蕉根圍采集耕作層土壤樣品,用于檢測土壤中細菌和真菌的數(shù)量。按五點采樣法采集土壤約100g,混勻后帶回實驗室檢測。稱取10g土樣至裝有90mL無菌水的滅菌三角瓶中,在渦旋器上充分震蕩1min,制成土壤懸浮液,做10倍濃度梯度稀釋至10-6。土樣細菌數(shù)量測定:用微量移液器從10-4、10-5、10-6稀釋液中各取0.1mL,分別涂布至NA培養(yǎng)基平板上,28℃下倒置培養(yǎng),每份3次重復(fù);24h后選擇每皿出現(xiàn)30～100個菌落的平板,對培養(yǎng)基上肉眼可見的細菌單菌落進行計數(shù),計算土樣細菌數(shù)量。土樣真菌數(shù)量測定:用微量移液器從10-2、10-3、10-4稀釋液中各取0.1mL,分別涂布至孟加拉紅培養(yǎng)基平板上,28℃下倒置培養(yǎng),每份3次重復(fù);36h后選擇每皿出現(xiàn)30～100個菌落的平板,對培養(yǎng)基上肉眼可見的真菌單菌落進行計數(shù),計算土樣真菌數(shù)量。每克土樣的含菌數(shù)量計算方法同1.2。1.5發(fā)病率和防治效果2012年12月10日,調(diào)查香蕉枯萎病發(fā)病情況,記錄試驗區(qū)每株香蕉是否感病,計算各處理小區(qū)發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率(%)=感病株數(shù)總株數(shù)×100(%)=感病株數(shù)總株數(shù)×100相對防效(%)=對照區(qū)發(fā)病率?處理區(qū)發(fā)病率對照區(qū)發(fā)病率×100(%)=對照區(qū)發(fā)病率-處理區(qū)發(fā)病率對照區(qū)發(fā)病率×1002結(jié)果與分析2.1不同土中木霉數(shù)量的變化如圖1所示,木霉在滅菌土壤和自然土壤中的數(shù)量總體變化趨勢大致相同,短期內(nèi)上升而后逐漸下降;在14d前上升趨勢明顯。所不同的是,木霉在滅菌土中的最高數(shù)量可維持相當長的時間,在第14天至第28天之間無明顯變化;而自然土中的木霉數(shù)量自第14天達到峰值后便開始逐漸下降。在滅菌土中,木霉數(shù)量在28～35d之間迅速下降,但自35d之后直至試驗結(jié)束的第63天,其數(shù)量仍高于第7天時的數(shù)量。而在自然土中的木霉數(shù)量自第49天起便開始低于第7天的數(shù)量。總體上,在整個試驗周期內(nèi)滅菌土中的木霉數(shù)量始終高于自然土。2.2土壤細菌數(shù)量木霉制劑在田間施用時,香蕉根圍土壤中的細菌數(shù)量結(jié)果見表1。第1次處理前(6月29日)檢測結(jié)果顯示,處理區(qū)土壤細菌數(shù)量與對照區(qū)相當。兩次處理后(8月21日和10月23日)檢測結(jié)果顯示,處理區(qū)土壤細菌數(shù)量略高于對照區(qū),但未達顯著水平。各處理的細菌數(shù)量均以8月21日為最高,這可能與7、8月份地溫較高,雨量較為充沛,土壤環(huán)境更適于細菌生長繁殖有關(guān)。2.3土壤真菌數(shù)量的變化木霉制劑田間施用后,香蕉根圍土壤真菌的檢測結(jié)果見表2。第1次處理前(6月29日)檢測結(jié)果顯示,各處理區(qū)土壤真菌數(shù)量與對照區(qū)相當。第1次處理后(8月21日)的檢測結(jié)果顯示,處理Ⅰ和處理Ⅱ的土壤中的真菌數(shù)量明顯增加,分別為10.98×104和6.01×104CFU/g,極顯著高于對照區(qū)。第2次處理后(10月23日)的檢測結(jié)果顯示,處理Ⅰ的土壤真菌數(shù)量又有顯著上升,增加至19.06×104CFU/g;處理Ⅱ中的土壤真菌數(shù)量增加不明顯,但仍顯著高于對照區(qū)。2個施入木霉制劑的處理土壤中,真菌的數(shù)量均顯著增加;其中,又以施入自制菌劑處理的土壤真菌數(shù)量增加更為明顯。2.4霉菌制劑處理前后血糖的比較12月10日,調(diào)查香蕉枯萎病發(fā)病情況,結(jié)果見圖2。自制木霉菌劑處理區(qū)和木霉菌粉劑處理區(qū)的發(fā)病率分別為13.8%和20.6%,明顯低于對照區(qū)的發(fā)病率(37.8%)。2種木霉制劑對枯萎病均有一定防效,但自制木霉菌劑處理區(qū)的防效(63.5%)明顯高于木霉菌粉劑處理區(qū)的防效(45.5%)。3木霉菌劑在土壤中的定殖在土傳病害的生物防治實踐中,生防菌在土壤中能夠成功定殖并長期占領(lǐng)有利的生態(tài)位點是獲得較好防治效果的關(guān)鍵因素之一。本研究結(jié)果顯示,木霉在滅菌土壤中的定殖能力明顯好于非滅菌的土壤。因此在施用木霉菌劑前,先對土壤采取各種消毒處理,降低其他雜菌在土壤中的數(shù)量,當木霉施入土壤中時,便可較好定殖,成為土壤微生物中的優(yōu)勢群體,改善土壤的微生態(tài)環(huán)境,有效抑制病原菌的生長,這與邱登林等的研究結(jié)果相一致。同時,應(yīng)注意在采取土壤消毒措施后,在相應(yīng)的殺菌劑殘效期消除后,盡快施入木霉制劑。否則經(jīng)殺菌劑處理的土壤中各種微生物數(shù)量會在殺菌劑作用減弱時迅速增長,而失去木霉占領(lǐng)有利生態(tài)位的最佳時機。與木霉菌粉劑相比,自制木霉菌劑在土壤中定殖快、數(shù)量多。這是由于自制的木霉菌劑采用木薯渣等農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì),這些基質(zhì)富含淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),為木霉