木薯抗細(xì)菌性枯萎病鑒定接種細(xì)菌懸浮液接種方法的比較

木薯抗細(xì)菌性枯萎病鑒定接種細(xì)菌懸浮液接種方法的比較

甘薯是一種耐旱、易稀釋的冬末谷物。與甘薯和甘薯一起被稱為三種谷物。這是亞熱帶和亞熱帶農(nóng)民的重要食物和經(jīng)濟(jì)收入來源之一。木薯細(xì)菌性枯萎病(病原菌:Xanthomonasaxonopodispv.manihotisVauterin,Kerters&Swings)是國(guó)內(nèi)檢疫對(duì)象,該病最初報(bào)道在巴西發(fā)生,后蔓延至南美洲、非洲及亞洲部分國(guó)家。染病木薯危害嚴(yán)重,而化學(xué)防治難以奏效,病田一般減產(chǎn)30%～50%,嚴(yán)重時(shí)可絕收。該病菌隨種莖、薯干及種子等材料的調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,具有帶菌未顯病癥的特點(diǎn),病株組織含菌量小于3×102～104cfu/mL時(shí),PCR擴(kuò)增檢測(cè)不到特征性譜帶。傳統(tǒng)的植物檢疫手段存在局限性。隨著我國(guó)加入WTO并與疫區(qū)國(guó)家進(jìn)行木薯產(chǎn)品的交流,木薯細(xì)菌性枯萎病在我國(guó)擴(kuò)散危害的形勢(shì)十分嚴(yán)峻,如對(duì)該病控制不力,將對(duì)我國(guó)木薯生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。我國(guó)木薯研究始于20世紀(jì)50年代,但工作多集中在品種資源的收集和保存、品種選育與推廣、高產(chǎn)栽培技術(shù)及深加工技術(shù)等方面。種植抗病品種是防治植物病害流行的經(jīng)濟(jì)有效的措施,但目前國(guó)內(nèi)尚未見到對(duì)木薯細(xì)菌性枯萎病抗性鑒定技術(shù)研究的報(bào)道。因此,對(duì)木薯細(xì)菌性枯萎病進(jìn)行抗源篩選、評(píng)價(jià)和利用缺乏依據(jù),制約了抗病育種工作的開展。為了探討木薯細(xì)菌性枯萎病抗性鑒定技術(shù)及其在抗病育種上的應(yīng)用前景,本試驗(yàn)于2007～2008年在隔離的玻璃網(wǎng)室內(nèi),對(duì)木薯細(xì)菌性枯萎病抗性測(cè)定方法進(jìn)行了研究,以期為我國(guó)木薯抗病品種選育工作的開展提供技術(shù)支撐。1材料和方法1.1供試菌株鑒定以木薯細(xì)菌性枯萎病菌BH-1菌株為供試菌株。該菌株是從病害樣本(廣西植?？傉局参餀z疫站提供)分離獲得,經(jīng)柯氏法則測(cè)定致病性后在-30℃下保存。1.2試驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯品種供試木薯品種為GR911(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供)。1.3試驗(yàn)內(nèi)容和方法1.3.1細(xì)菌懸浮液的制備和接種將病菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母膏1g、蔗糖10g、瓊脂17g、蒸餾水1000mL)上培養(yǎng)48h,再用無菌水配制成108cfu/mL細(xì)菌懸浮液備用。在木薯生育前期分別采用以下幾種方法進(jìn)行接種:①刷葉法,用無菌牙刷蘸1次細(xì)菌懸浮液后輕刷1次小葉;②壓傷滴菌法,無菌膠頭滴管先吸取細(xì)菌懸浮液,再用滴管口輕壓小葉,使其形成微傷口,然后用手?jǐn)D膠頭,滴一滴細(xì)菌懸浮液在微傷口上;③剪葉法,用無菌剪刀蘸1次細(xì)菌懸浮液后剪1張小葉,剪去葉尖的葉面積約占整張葉片面積的1/10;④普通針刺法,把針距為1.0cm×1.0cm的6根大頭針固定在橡皮上滅菌后,將其蘸1次細(xì)菌懸浮液后刺傷1張小葉;⑤傷根淋菌法,先對(duì)木薯根部進(jìn)行翻耕傷根,然后用3×107cfu/mL細(xì)菌懸浮液淋根,每株淋1L,設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)淋5株木薯;⑥噴霧法,用手提式噴霧器對(duì)木薯葉片均勻噴施細(xì)菌懸浮液,設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)噴霧接種5株木薯,保濕2d,第10天后調(diào)查記載病情;⑦改良針刺法,把針距為1.0cm×1.0cm的4根大頭針固定在橡皮上滅菌備用。用直徑為9cm的無菌海綿吸足細(xì)菌懸浮液后置于培養(yǎng)皿內(nèi),在海綿上疊4～8張小葉,用帶橡皮的大頭針刺一下后,再將橡皮擠壓一下海綿至擠出菌液再拔出,每個(gè)重復(fù)刺5株木薯葉片,每株接種3～5次,第10天后調(diào)查記載病情,設(shè)3個(gè)重復(fù),接種過程注意給海綿補(bǔ)充細(xì)菌懸浮液(下同)。以上的刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法、普通針刺法均設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)接種5株木薯葉片,每株接種3～5張復(fù)葉,每張復(fù)葉接種4～7張小葉,接種后第10天調(diào)查記載病情。1.3.2針孔發(fā)病率調(diào)查將病菌用無菌水配成濃度為3×109cfu/mL的細(xì)菌懸浮液,逐級(jí)稀釋10倍,分別配制成3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL共8個(gè)濃度梯度后,在木薯生育前期用改良針刺法接種,分別在接種后第4天、第6天、第8天、第10天調(diào)查記載針孔發(fā)病率,第10天調(diào)查記載病情級(jí)別。1.3.3調(diào)查記錄及銜接在木薯生育前期分別對(duì)木薯葉片、莖稈、根部進(jìn)行接種:對(duì)葉片用改良針刺法進(jìn)行接種,接種后第10天、第15天分別調(diào)查記載病情級(jí)別;對(duì)莖稈用無菌解剖刀斜切皮部后再向下縱剖1～2cm,然后將帶菌棉團(tuán)夾于斜切傷口部位,接種后分別在第15天、第30天分批測(cè)量莖稈病部褐變組織長(zhǎng)度;對(duì)根部進(jìn)行深翻傷根,然后每株用1L細(xì)菌懸浮液(3×106cfu/mL)淋根,接種后分別在第30天、第60天調(diào)查記載病情。1.3.4根據(jù)病斑長(zhǎng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí)和9級(jí)對(duì)于接種傷口較小的普通針刺法、改良針刺法均采用以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載病情:0級(jí)為針孔無癥狀;1級(jí)為病斑長(zhǎng)度小于0.5cm;3級(jí)為病斑長(zhǎng)度0.6～1.5cm;5級(jí)為病斑長(zhǎng)度1.6～2.5cm;7級(jí)為病斑長(zhǎng)度2.6～4.0cm;9級(jí)為病斑長(zhǎng)度大于4.0cm。而對(duì)于接種傷口較大的刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法及無傷接種的噴霧法、傷根淋菌法均采用以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載病情:0級(jí)為葉片無病斑;1級(jí)為病斑占葉面積1/10以下;3級(jí)為病斑占葉面積1/10～1/4;5級(jí)為病斑占葉面積1/4～1/2;7級(jí)為病斑占葉面積1/2～3/4;9級(jí)為病斑占葉面積3/4以上。2結(jié)果與分析2.1接種后病情變幅不同接種方法的抗性鑒定結(jié)果見表1,采用噴霧法、傷根淋菌法接種不發(fā)病,其他接種方法接種后均發(fā)病,而且病葉率均較高(93.2%以上)。刷葉法、壓傷滴菌法、剪葉法3種方法接種后病情變幅較大,病指在3～9級(jí)。普通針刺法與改良針刺法接種后潛伏期為5～6d,病葉率較高(98.6%以上),病情變幅較小,病指在7～9級(jí),較為穩(wěn)定。工作量以剪葉法與改良針刺法相對(duì)較少。2.2接種細(xì)菌懸浮液濃度試驗(yàn)結(jié)果見表2,當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度為3×102cfu/mL時(shí),接種后第10～30天未觀察到病狀;接種細(xì)菌懸浮液濃度達(dá)3×103cfu/mL時(shí),接種后第8～10天觀察到針孔發(fā)病;當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度為3×107～3×108cfu/mL時(shí),針孔發(fā)病率高,病情穩(wěn)定,接種后同一品種病株之間的病情級(jí)別變幅不大;當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度達(dá)3×109cfu/mL時(shí),病情級(jí)別均為9級(jí);當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度低于3×106cfu/mL時(shí),同一品種病株之間的病情級(jí)別在0～9級(jí)。2.3髓部褐變組織生長(zhǎng)情況植株不同部位的接種結(jié)果見表3,用改良針刺法對(duì)葉片進(jìn)行接種,發(fā)病充分,兩年的病情結(jié)果穩(wěn)定。在木薯莖稈中上部斜切接種帶菌棉團(tuán),植株髓部褐變組織長(zhǎng)度兩年的結(jié)果差異較大。采用菌液淋根法接種,兩年的結(jié)果一致,接種后第30～60天沒有觀察到植株葉片、莖稈髓部和根塊發(fā)病。3抗性鑒定方法的選擇當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度達(dá)3×109cfu/mL時(shí),植株發(fā)病快而且病情級(jí)別偏高,供試品種均表現(xiàn)為高感,而當(dāng)接種細(xì)菌懸浮液濃度低于3×106cfu/mL時(shí),植株發(fā)病慢且病情級(jí)別變幅較大,兩者均難以區(qū)分品種的抗感反應(yīng)。可初步認(rèn)為接種細(xì)菌懸浮液適宜濃度為3×107～3×108cfu/mL;改良針刺法和剪葉法由于工作量相對(duì)較少,對(duì)大批量品種進(jìn)行抗性鑒定初篩宜采用改良針刺法或剪葉法,而復(fù)篩和抗性穩(wěn)定性測(cè)定再用普通針刺法進(jìn)行篩選,其他接種方法因在同一品種上的病級(jí)變幅較大,難以表現(xiàn)品種的抗感性;接種的部位以葉片為宜,不僅發(fā)病充分,便于調(diào)查記載,而且兩年的試驗(yàn)結(jié)果病情級(jí)別變幅不大,重復(fù)性好。對(duì)木薯細(xì)菌性枯萎病進(jìn)行抗性鑒