綠色木霉菌對黃瓜立枯病及枯萎病的防治效果

綠色木霉菌對黃瓜立枯病及枯萎病的防治效果

中國是世界上的主要蘑菇產(chǎn)區(qū)。然而，隨著蘑菇產(chǎn)業(yè)的繁榮，也存在一些問題。它的副產(chǎn)品是令人難以置信的蘑菇。目前,蘑菇菌糠沒有較好的回收利用手段,蘑菇生產(chǎn)后廢棄的菌糠對環(huán)境將會造成一系列的嚴重后果,其傳統(tǒng)的處理方法是丟棄或燃燒,不但造成資源浪費,同時導致霉菌和害蟲滋生,從而造成環(huán)境污染。此外,廢棄的平菇菌糠中還蘊藏著極其豐富的木霉,其中不乏生命力強及抗病性強的菌株,利用綠色木霉對廢棄的菌糠進行發(fā)酵處理,生產(chǎn)大量的具有一定生防價值的發(fā)酵產(chǎn)品對資源的經(jīng)濟利用及環(huán)境保護都是有重要的意義。國內(nèi)對菌糠利用的研究起步較晚,主要集中在將其二次利用栽培食用菌、直接作為有機肥料或土壤改良劑還田、經(jīng)簡單處理或發(fā)酵后作為動物飼料的研究探索等。相對而言,國外研究較為成熟,甚至已經(jīng)涉及到環(huán)境保護、能量再生等方面。林懷忠等將菌糠粉碎后放在陽光下暴曬至適干,然后與腐熟的雞糞、碳渣灰混合后直接對黃瓜、辣椒、番茄、茄子施用,其在生長期表現(xiàn)為葉色濃綠,葉片厚而挺拔,植株生長粗壯等優(yōu)良性狀。朱小平等研究了有益微生物與菌糠復合物對辣椒、菠菜、小白菜、不結(jié)球白菜等蔬菜產(chǎn)量及營養(yǎng)元素吸收和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明,鏈霉菌和巨大芽孢桿菌與菌糠的復合肥料可以促進土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、提高產(chǎn)量、增加營養(yǎng)元素吸收,還發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫下施用含有鏈霉菌和巨大芽孢桿菌的菌糠復合肥料,有利于豌豆生長、促進結(jié)瘤、提高光合能力、提高產(chǎn)量。綠色木霉在植物真菌病害防治上一直都是人們所關注的焦點,然而如何通過簡單廉價的方法大量獲得卻是實際應用的一大瓶頸。Michael在隨機選取30個新鮮菌糠樣品,進行了成分統(tǒng)計分析得到,菌糠中含有氮、磷、鉀等大量營養(yǎng)元素,鈣、鎂、硫等中量營養(yǎng)元素,銅、鋅、鐵、錳等微量元素。這些營養(yǎng)元素有的是酶、維生素、激素的重要組成部分,或直接參與機體的代謝過程,能夠提高植物酶的活性,或?qū)ξ⑸锏年P鍵代謝存在一定的調(diào)節(jié)作用。而且菌糠中豐富的有機質(zhì),大量的碳源,在適量添加氮源后即可用來培養(yǎng)微生物。本研究中用到的綠色木霉是本實驗室經(jīng)過大量篩選試驗從平菇菌糠中獲得的一株對立枯絲核菌及尖孢鐮刀菌有較強抗性的菌株(LTR-2),將其分別采用不同培養(yǎng)方法大量獲得后接種到菌糠上,考察了其對黃瓜立枯病及枯萎病的防治效果。在確定利用少量滅菌菌糠培養(yǎng)后獲得的發(fā)酵產(chǎn)物能夠較好地對兩種病害具有較高防效的同時,又對其在拌土比例和拌土堆置時間的條件優(yōu)化上進行進一步的實驗。創(chuàng)新之處在于大量菌糠發(fā)酵時模擬田間實際環(huán)境條件,采用堆肥管理,這樣能夠在較短時間、較為簡單的操作控制下獲得發(fā)酵產(chǎn)品,便于指導實際生產(chǎn)。此外,生防菌株綠色木霉亦來自菌糠,從而具有一定的生長優(yōu)勢,通過兩者的結(jié)合使用,既獲得了大量的生防因子,同時又處理了一些廢棄物,對未來綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的價值不言而喻。1材料和方法1.1材料與培養(yǎng)方法供試菌種:綠色木霉(Trichodermaviride)LTR-2,立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani),尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜所綜防課題組保存。培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂18g,水1000mL),PD培養(yǎng)基(馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水1000mL)。供試黃瓜品種為中農(nóng)6號,栽培土來自中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜所綜防課題組溫室大棚。病原菌菌懸液制備:將立枯絲核菌接種到PD培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),然后將其在630nm下調(diào)節(jié)至吸光度為3.46%的病原菌菌懸液,尖孢鐮刀菌則制成濃度為3×106個/mL的孢子菌懸液。綠色木霉的制備:將在PDA上培養(yǎng)的綠色木霉配成109個/mL的孢子菌懸液;綠色木霉在PD培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng),培養(yǎng)液雙層紗布過濾除去菌絲,制成濃度為109個/mL的孢子懸液;少量菌糠滅菌后接種綠色木霉,培養(yǎng)5～7d后將其轉(zhuǎn)接到大量未進行滅菌處理的菌糠上,進行堆肥管理,調(diào)查孢子濃度為109個/g備用[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。種子處理:將黃瓜種子用清水沖洗,然后浸泡12h,放在28℃恒溫箱催芽,當胚根長至1cm左右時進行種苗。1.2測試方法1.2.1抗性菌木霉的培養(yǎng)分別挑取立枯絲核菌與尖孢鐮刀菌菌絲接種于兩個不同PDA平板中央,28℃下培養(yǎng)1d后分別在離病原菌約2cm處接種拮抗菌綠色木霉,28℃下再培養(yǎng)4d,觀察抑菌帶寬度,每個處理3次重復。1.2.2混合木霉pd發(fā)酵物與栽培土混中酵母粉的制備菌糠發(fā)酵物與未發(fā)酵菌糠分別按照10%的添加比例與栽培土混拌均勻,綠色木霉PD發(fā)酵物與綠色木霉孢子菌懸液也與栽培土混拌均勻(保證其孢子濃度與菌糠發(fā)酵物的孢子濃度一致)。只含栽培土基質(zhì)作為對照,以上每組處理分別分裝于50個栽培砵。1.2.3綠色木霉素的比例對黃瓜的消毒菌糠發(fā)酵物的拌土比例分別為2%、5%、10%、15%、20%,只含栽培土基質(zhì)作為對照組處理,以上每組處理分別分裝于50個栽培砵。1.2.4綠色木霉菌糠對黃瓜枯渙病的防治試驗菌糠發(fā)酵物的添加比例為10%,分別拌土堆置0、3、6、9、15d后備用,只含栽培土基質(zhì)作為對照,以上每組處理分別分裝50個栽培砵。綠色木霉菌糠發(fā)酵物對黃瓜枯萎病的防治試驗方法與立枯病相同,將黃瓜種子播種于裝好的栽培砵中,然后在栽培砵中分別注入已配制好的病原菌菌懸液,以上每個處理5次重復,每次重復10株苗。3～5d出芽后調(diào)查發(fā)病情況,并計算防治效果。試驗數(shù)據(jù)采用Excel2003進行處理分析。2結(jié)果與分析2.1菌的抗性作用從表1可以看出,綠色木霉對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌兩種病原菌都存在較強的拮抗作用,分別達到了66.8%及87.5%,其對病原菌的拮抗作用一般表現(xiàn)為競爭重寄生。其平板試驗也可觀察到其與病原菌相互纏繞,交界處其病原菌萎縮或生長受限。2.2菌糠和黃瓜的生長特性綠色木霉菌糠發(fā)酵物對黃瓜立枯病及枯萎病的防治效果達到75.2%和65.3%(圖1),分別高于綠色木霉PD培養(yǎng)基發(fā)酵物接種方式和綠色木霉菌懸液接種方式的防效。主要利用了綠色木霉分離于菌糠這一特點,由此,在少量滅菌菌糠中接種綠色木霉,其會快速生長,也就是說獲得了一定量的具有綠色木霉生長優(yōu)勢的種子菌糠,相對其他接種方式自然更利于綠色木霉的穩(wěn)定生長。需要指出的是未發(fā)酵菌糠對黃瓜立枯病的防治也能起到一定的效果。菌糠含有較為豐富的有機質(zhì)、酶類、殘余菌絲等,在對綠色木霉的生長定植及有效抗性產(chǎn)物代謝方面起到一定的積極意義,從而對兩種病害具有相對較高的防治效果。菌糠具有很好的通透性和保水性,能有效地改善了土壤理化性狀和微生態(tài)環(huán)境,為作物根系創(chuàng)造較好的生長環(huán)境,本身被代謝降解后,釋放一些物質(zhì)可能對黃瓜植株本身防御病害能力起到一個提高的作用。2.3菌糠和其他添加比例對植株生長和電導率的影響綠色木霉菌糠發(fā)酵物的添加比例直接影響其生防因子的數(shù)量,但由于菌糠各種理化指標的局限性,其添加量并不是越多越好。可以看出其添加量為10%時對病害的防效達到78.3%和71.4%(圖2),高于其他添加比例的抗病效果。菌糠一方面能為綠色木霉提供一個較為理想的定植環(huán)境,但過量的菌糠引入會導致植株生長環(huán)境中營養(yǎng)元素、碳氮源比例等的改變,打破這樣一個穩(wěn)定的微環(huán)境可能對其生長產(chǎn)生負面影響。在整個發(fā)酵過程中,不排除產(chǎn)生其他微生物,過量引入則導致其他非可控因素影響的增加,實際應用中過高比例的添加量也缺乏應用前景,關鍵還是在于盡量用較少菌糠獲得大量綠色木霉(即較高的孢子濃度)。其菌糠中相對較高的電導率對植株生長也并不是十分有利。菌糠添加量較小,則生防菌的含量也隨之減少,達不到對病害較好的防治效果。2.4綠色木霉的生長綠色木霉菌糠發(fā)酵產(chǎn)物拌土時間為6d時,其對黃瓜立枯病及枯萎病的防治效果較好,分別達到85.6%和74.3%(圖3)。拌土時間較短,則不利于綠色木霉的定植,未適應新環(huán)境的同時對病害的防治效果自然不高。拌土時間太長則影響其綠色木霉抗病活性,或積累一些對植株生長不利的次級代謝產(chǎn)物,菌糠的長時間堆置勢必會滋生其他微生物,嚴重影響其發(fā)酵菌糠的品質(zhì),實際應用中會造成利用效率大大降低。3不同種類菌糠防治效果綠色木霉與菌糠的結(jié)合利用在黃瓜立枯病及枯萎病的防治和植株生長上具有一定的積極作用,通過對其應用方式的研究可知,其最佳處理方式為綠色木霉接種菌糠發(fā)酵,拌土比例10%且堆置6d后對兩種病害具有較高防效,這與高葦?shù)难芯拷Y(jié)果相近。Choi等認為在防治仙人掌莖腐病的研究上,在接種病菌的土壤中,菌糠的加入有助于降低發(fā)病率3%～12%,而未加入菌糠接種病菌土壤的發(fā)病率為44%～59%,本研究也顯示了未發(fā)酵菌糠對兩種病害存在一定的防效,菌糠本身富含大量營養(yǎng)元素,還存在一些菇類殘余菌絲或一些抗病相關的次級代謝產(chǎn)物,其疏松多孔、優(yōu)良的保水性等特點對植物生長有著一定的積極作用。菌糠的種類較多,成分更是復雜,本研究則針對平菇菌糠,實際應用中搞清楚其背景至關重要,不同種類菌糠在應用中也存在一定的差異。生物制品的穩(wěn)定性問題至今仍是很難攻克,當然,綠色木霉發(fā)酵菌糠也不例外,因此,尋找抗逆性更高的微生物菌株,或采取突變育種、分子生物學等技術以提高其應對環(huán)境變化的能力。本研究對綠色木霉菌糠發(fā)酵物抗病效果僅考慮其生防因子的濃度,而忽略了對其代謝產(chǎn)物,以及是否促進有益微生物共生而起到抗病能力的研究,主要是在相對粗放的條件控制下,孢子濃度的測量較為簡單直觀,大量研究也表明綠色木霉對真菌的防治主要是其重寄生、抗生及競爭作用,這些特點都與其濃度存在正相關性。相關研究表明,綠色木霉還能提高防御酶的活性,誘導酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成,生物土壤添加劑的應用還能顯著提高根系脫氫酶的活性,脫氫酶