微生物學實驗10

實驗10濾膜法測定水中總大腸菌群一、實驗目的

了解大腸菌群的檢測方法。

背景知識大腸菌群的定義:大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：在37℃24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬等。大腸菌群=大腸桿菌嗎？大腸菌群包括大腸桿菌。大腸菌群指能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)習慣稱為大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸菌群的衛(wèi)生意義大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。為什么？糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），呈正相關性。因而利用大腸菌群數(shù)反映水體或食品中的糞便污染狀況，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。

為何不直接測定致病菌數(shù)量？p204大腸菌群的檢驗比較簡單，但其和糞便污染的相關性還受到質(zhì)疑，原因是其中的一些細菌能夠在環(huán)境樣品中檢出。

相對來說，糞大腸菌群對糞便污染的指示作用更為直接和貼切，而且檢測方法相對大腸桿菌簡單，為此是一種較好的糞便指示菌（或稱為“指示菌群”）。與大腸菌群相比，糞大腸菌群在人和動物糞便中所占的比例較大，而且在自然界容易死亡。因此，糞大腸菌群的存在表明食品可能直接或間接的受到了近期的糞便污染。糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，主要就是大腸桿菌，但也包括克雷伯氏菌屬。題外2原理（濾膜法）濾膜是一種微孔薄膜，選擇孔徑為0.45~0.65μm的濾膜，能濾過大量水樣，并將水中含有的細菌截留至濾膜上，然后將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，直接計數(shù)濾膜上生長的典型大腸菌群菌落，算出每升水樣中含有的總大腸菌群數(shù)伊紅美藍瓊脂含有伊紅和美藍兩種苯胺類染料，它們可以抑制革蘭氏陽性菌的生長。同時，這些染料可以區(qū)分那些發(fā)酵乳糖的微生物。大腸菌群因其強烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量的混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染料，伊紅與美藍結(jié)合，菌體被著上深紫色，在含有兩種染料的培養(yǎng)基上，形成帶核心、具金屬光澤的菌落。

3實驗材料濾器6套濾膜，孔徑0.45~0.65μm。直徑根據(jù)濾器規(guī)格，目前常用的有2.5cm和4.7cm兩種抽濾設備7臺尖頭鑷子6把

恒溫箱95%酒精及酒精棉，用于灼燒滅菌過濾器采樣瓶、移液槍及槍頭伊紅美蘭瓊脂平板4實驗步驟4.1準備工作4.1.1水樣采集4.1.2濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次，以除殘留溶劑。4.1.3配制伊紅美藍平板（已配）4.1.4濾器滅菌：用點燃的酒精棉球，火焰滅菌。也可用121℃滅菌20min5.2過濾水樣

5.2.1用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，帖放已滅菌的濾床上，穩(wěn)妥地固定好濾器，將10mL（1mL、0.1mL）水樣注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在負壓0.5大氣壓下抽濾。（每個梯度兩個平行）5.2.2水樣過濾完后，暫不關過濾泵，取下濾器，于負壓下用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣