原核表達(dá)及蛋白質(zhì)的純化

原核表達(dá)及蛋白質(zhì)的純化原核表達(dá)及蛋白質(zhì)的純化與濃度測定之一原核表達(dá)一(實驗材料大腸桿菌BL21.DH5a高鹽LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低鹽LB為5g)，溶于雙蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高壓滅菌25min-30min后備用LB固體培養(yǎng)基:按上述方法配制的液體培養(yǎng)基，每100ml加1.5g瓊脂粉，高壓滅菌25min-30min，待培養(yǎng)基溫度降至常溫左右時(一般為不燙手即可)，在無菌狀態(tài)加入抗生素(3g/200ml)并鋪平板，冷卻凝固后放入4?備用4.IPTG(異丙基硫代-B-D-半乳糖苷)：在8ml蒸餾水中溶解2gIPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22um濾器過濾除菌，分裝成1ml小份貯存于-20?，這時配好的。IPTG濃度為0.8m/mL氨芐青霉素(ampicillin)(100mg/ml):溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20?貯存。常以25ug/ml,50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml):溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20?貯存。常以25ug/ml,50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基?？捡R斯亮蘭染色液:稱取1g考馬斯亮藍(lán)R-250,置于1L燒杯中，量取250mL的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。加入100mL的冰乙醋酸，均勻攪拌。加入650mL的去離子水，均勻攪拌。用濾紙出去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。考馬斯亮蘭脫色液:量取下列溶液，醋酸（冰乙酸）45mL;甲醇50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。9.10%過濾酸銨：把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4?保存數(shù)周。10.5XTris-GlycineBuffer（SDS電泳緩沖液）配制方法：稱取下列試劑，置于1L燒杯中。Tris15.1g;Glycine94g;SDS5.0g;加入約800mL的去離子水，攪拌溶解。加去離子水將溶液定容至1L后，室溫保存。二（實驗原理大腸桿菌是重要的原核表達(dá)體系，在重組基因轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)。實驗室常采用異丙基硫代-B-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。三（操作程序及結(jié)果判定（一） 構(gòu)建重組表達(dá)載體1、 載體酶切:將原核表達(dá)載體（例如:pET-28a）用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收所需要的載體大片段。2、 PCR產(chǎn)物雙酶切后經(jīng)DNA純化與回收試劑盒（或者切膠回收）回收后，同樣在用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收所需要的片段。注:一般需要先連T載體克隆增值，然后再連原核表達(dá)載體。（二） 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或kan）作篩選，挑取單斑，用小提試劑盒抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架（有無因為堿基的缺失所造成的移碼），如果均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞（如BL21）。（三）誘導(dǎo)表達(dá)1、 挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至5ml低鹽LB液體培養(yǎng)基中含Amp或kan中37?過夜培養(yǎng)。注:A.同時做空載體（如pET28a）的誘導(dǎo)作為對照;本實驗室常用的Amp或Kan，若為A100（100mg/ml）的話5mLLB加5微升，若為K50（50mg/ml）的話5mLLB也加入5微升。B.接種表達(dá)和接種做感受態(tài)都類似，一定要用挑單克隆、加足量抗生素、過夜培養(yǎng)的新鮮菌液轉(zhuǎn)種最好，在篩選壓力下生長旺盛的種子液遠(yuǎn)比經(jīng)過4?保存的菌液要好得多，也許是因為保存時間長會導(dǎo)致抗生素失效部分細(xì)菌丟失質(zhì)?；蛘咂渌兓?、 按1?100比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含100ml高鹽LB液體培養(yǎng)基的250ml培養(yǎng)瓶中（最好是500ml，以免轉(zhuǎn)速太高碰到瓶口造成污染），37?震蕩培養(yǎng)至OD600?0.4-1.0（最好0.6，一般大約需2-3h，不同菌體時間不同）。3、取1ml液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.8mM（IPTG:液體培養(yǎng)基=1:1000，即100ml培養(yǎng)基加入100微升）作為實驗組，兩組繼續(xù)在37?中震蕩培養(yǎng)3h.4h.5h.6h。4、 分別取菌體1ml，離心12000rpmX1min或8000rpmX6min收獲沉淀（即菌體），用40微升滅菌水重懸沉淀，加入本實驗室常用的5XsdsTondingbuffer10微升混勻，沸水煮5min。導(dǎo)致樣品噴出來。注:煮樣品的時候要時刻關(guān)注樣品的情況，以免EP管壓力太高5、剩余的樣品（若用100ml的LB的話，這時剩余大約95ml左右），然后離心12000rpmX1min，用10ml滅菌水重懸菌體，用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀或超聲破碎破碎重懸的菌體，然后4?12000rpmX10min，上清倒入另一管中，沉淀用同樣含量的滅菌水（按照上面的量加的話，也為10mL）重懸，然后分別取40微升，加入本實驗室常用的5XsdsTondingbuffer10微升混勻，沸水煮5min，做SDS等分析。注:A.與超聲波相比，低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀的優(yōu)點有:保持細(xì)胞活性（4-6?的環(huán)境），省時，樣品損失少，可以處理大量樣品。不同菌體的破碎最適壓力是不同的，例如:一般大腸桿菌的破碎壓力為1000mpa，超過這個壓力的話也許會對蛋白的活性有影響，如果用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀破碎完之后離心時沒有沉淀，說明破碎之后的核酸太多，太粘了，可以用超聲在冰水的環(huán)境下連續(xù)破碎15S即可。但是當(dāng)破碎的樣品量小于5ml時，用超聲比較合適，因為低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀會有部分損失，也許破碎之后樣品就沒了，超聲破碎時一定要置于冰水混合物（比冰更利于散熱）中，而且一般破1min停3min（菌體不同，時間不同，自己摸索），超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握;超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)2-3次凍溶后更容易破碎。在破碎暫停的過程中晃動盛樣品的容器以利于散熱，破碎直至菌體變清亮即可，有時如果蛋白以包涵體的形式表達(dá)的話，是很難變清亮的，這個就需要大家摸索條件了。B.如果對蛋白的活性要求較高的話，而且確定蛋白是以可溶性的形式表達(dá)的話，可以考慮默克Novagen的Buster蛋白抽提試劑用于溫和破壞大腸桿菌細(xì)胞壁以釋放活性蛋白或者qiagen公司的蛋白抽提試劑，具體查閱以上公司的資料。C（在跑膠的時候一定要設(shè)對照，比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾娪緦φ?，?yīng)該是:Marker,標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照（如果有，且打算做Western的話），以及誘導(dǎo)空白載體（例如pET-28a）和不誘導(dǎo)重組載體2個陰性對照，再加上誘導(dǎo)不同時間的表達(dá)結(jié)果，。Marker用于判斷條帶大小，標(biāo)準(zhǔn)品用于判斷Western體系包括抗體顯色劑和操作的可靠性，以及精確判斷大小;誘導(dǎo)空白載體負(fù)對照有助于判斷在非誘導(dǎo)條件下的本底表達(dá);而不誘導(dǎo)重組載體負(fù)對照則有助于判斷誘導(dǎo)的效果以及排除誘導(dǎo)劑對宿主菌潛在的干擾。D.SDS的點樣順序:如果按照上面的操作做的話，點樣順序分別為marker，誘導(dǎo)空白載體，不誘導(dǎo)重組載體，3,4,5,6四個時間點（一般是這樣的，不同的重組表達(dá)質(zhì)粒有時不同，需要大家查閱相關(guān)文獻(xiàn)），上清，包涵體一共9個樣，本實驗室的梳子有些問題，最后一個孔有時會漏，大家點樣時注意一下，盡量把那個孔點成2Xsds-londing上樣緩沖液。如果蛋白較大的話可以跑的時間長一點，跑出來的效果較好，如果較小的話，例如10Kda左右，應(yīng)該用大濃度的膠（如15%或者更大濃度），最好用預(yù)染的marker能看清條帶的位置，這個是相對于小蛋白來說的，大蛋白沒必要。E（如果用新配置的考馬斯亮蘭染液的話染1小時即可，反復(fù)用過的染液最好染過夜，四（注意事項1、選擇表達(dá)載體時，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)（His或GST等標(biāo)簽）；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。2、融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時，應(yīng)對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。3、選擇表達(dá)載體的原則蛋白質(zhì)是否需要保留活性:有活性的以可溶性蛋白表達(dá)（胞質(zhì)蛋白），無活性的以不溶性形式的蛋白（包涵體蛋白），可以通過加標(biāo)簽促進(jìn)其以融合蛋白的形式表達(dá)。4、選擇表達(dá)宿主首先要看靶基因中有沒有細(xì)菌不常用的密碼子一一如果有，需要考慮換表達(dá)菌株。每種菌株都有自己獨特的設(shè)計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采用不同調(diào)控機(jī)制會使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，如果使用BL21（DE3）表達(dá)不成功的話可以換Rosetta系列菌株，Rosetta2系列就是一個好的選擇一一這種攜帶PRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時不明原因的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋镜妆磉_(dá)產(chǎn)物抑制。5、關(guān)于表達(dá)不出來的原因有很多A.那就是先查查表達(dá)外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點，不要設(shè)計重了，否則酶切時發(fā)現(xiàn)怎么老是有預(yù)期外的小片段出現(xiàn)。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設(shè)計上終止密碼子，這樣萬無一失?？纯词欠裼幸拼a的情況出現(xiàn)，看看稀有密碼子情況，因為有時你的目的蛋白表達(dá)豐度過低，SDS檢測不到可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。D..由于大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)缺少哺乳動物細(xì)胞特異的翻譯后加工，所以，其生物活性無法與天然蛋白質(zhì)相提并論。提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是優(yōu)化IPTG濃度與溫度，IPTG濃度-0.5mM（可以做個梯度從0.1,0.2,0.4,0.8,1,1.5,2）IPTG足夠了，不會降低表達(dá)0.2量，反而會增加蛋白的可溶性°IPTG濃度過高，易使蛋白表達(dá)速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白（包涵體）溫度:一般37?誘導(dǎo)3-4小時，30?誘導(dǎo)6小時是蛋。白表達(dá)的最大產(chǎn)量期。22?、18?、16?等低溫誘導(dǎo)時間在12h-48h。低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降（但表達(dá)總量會有所降低），可以考慮25?，誘導(dǎo)8-10個小時;20?誘導(dǎo)14-18個小時;甚至15?24-36小時誘導(dǎo)。重組質(zhì)粒和菌株的保存建議在實驗室里保存重組菌株的時候，為了挑菌和傳代方便，我們常用LB平板保存在4?冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。我們建議：長期存放菌株和pET重組子應(yīng)該存在甘油，70?保種。但是要注意高濃度甘油（＞10%）會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請盡量保持甘油濃度8,o（15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行）重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達(dá)菌株（帶DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有recAendA突變的克隆菌株（比如C600，DH5a）進(jìn)行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題。蛋白表達(dá)出來了，但是跑SDS時大小不符，進(jìn)行SDS的時候蛋白的凈電荷會影響遷移率。帶電量高的蛋白會結(jié)合較少的SDS，因此阻礙了蛋白的泳動。富含脯氨酸的蛋白會在SDS膠中移動得特別慢。如果蛋白的等電點在5到9之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好，那么目的蛋白遷移率與預(yù)期相差較遠(yuǎn)就很有可能不是由于凝膠電泳造成的。我們前面提到過，在很特殊的情況下稀有密碼子的問題也會造成表達(dá)產(chǎn)物的截短，應(yīng)加以考慮?？赡軙嗖?0kDa左右本實驗室的優(yōu)化步驟：如果在37?表達(dá)且是上清的話，只需優(yōu)化一下IPTG的濃度以及誘導(dǎo)時間。如果是包涵體的話，但是需要在上清中表達(dá)提高活性的話，可以換載體，例如:PGEX-KG能更好的以可溶形式表達(dá)蛋白；還可以通過低溫誘導(dǎo)，例如：18?誘導(dǎo)過夜，而且IPTG濃度要降低（因為對菌體細(xì)胞有毒性影響，誘導(dǎo)時間長影響蛋白表達(dá)量），可以在5mlLB中加入1.5微升IPTG，以此相對應(yīng)的濃度計算，確定它是否可以以可溶性的形式表達(dá)，然后再優(yōu)化IPTG濃度以及誘導(dǎo)時間，一般是8h,12h,16h,20h,24h，IPTG濃度可以從0.05mM,0.1mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM，做梯度，以此摸索條件提高表達(dá)量。原核表達(dá)及蛋白質(zhì)的純化與濃度測定之二蛋白質(zhì)的提取與純化一（實驗材料（一） .BufferA配方：1LTris-base50mM0.05X121.4=6.07gEDTA0.5mM0.0005X372.24=0.1861gNaCl50mM0.05X58.44=2.922g甘油5%50MLDTT5mM（本實驗室的操作方法是不直接加到BufferA中，而是單獨配，用另外加）。BufferA一般置于4?保存（二） .DTT（0.5M/L）0.5X154.25=77.125g/L，可長期放置與-20?中,,,的,，，（十二烷基肌氨酸鈉）：20g/100mL，最好現(xiàn)用現(xiàn)配（三）.（四） .氧化型谷胱甘肽:0.03g/mL，最好現(xiàn)用現(xiàn)配（五） .還原型谷胱甘肽:0.03g/mL，最好現(xiàn)用現(xiàn)配（六） .10XTEBuffer（pH7.4,7.6,8.0）組份濃度：100mMTris-HCl,10mMEDTA配制量：1L配制方法：量取下列溶液，置于1L燒杯中。1MTris,HClBuffer（PH7.4，7.6，100ml8.0）500mMEDTA（PH8.0）20ml向燒杯中加入約800ml的去離子水，均勻混合。3.將溶液定容至1L后，高溫高壓滅菌。室溫保存。1)1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)組份濃度：1MTris-HCl配制量:1L配制方法：稱量121.1gTris置于1L燒杯中。加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要的pH值。PH值濃HCl7.4約70ml7.6約60ml8.0約42ml將溶液定容至1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意:應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1?，溶液的pH值大約降低0.03個單位。2)0.5MEDTA(pH8.0)組份濃度:0.5MEDTA配制量:1L配制方法:稱取186.1gNa2EDTA?2H2O,置于1L燒杯中。2.加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢琛?.用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0(約20gNaOH)。注意:pH值至8.0時，EDTA才能完全溶解。4.加去離子水將溶液定容至1L。適量分成小份后，高溫高壓滅菌。室溫保存。3)1.5MTris-HCl(pH8.8)組份濃度：1.5MTris-HCl配制量：1L配制方法：稱量181.7gTris置于1L燒杯中。加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8。將溶液定容至1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意:應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1?，溶液的pH值大約降低0.03個單位。(七)1XPBSBuffer組份濃度：137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4配制量：1L配制方法：稱量下列試劑，置于1L燒杯中。NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.42gKH2PO40.27g向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴加濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4，然后加入去離子水將溶液定容至1L。4.高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意:上述PBSBuffer中無二價陽離子，如需要，可在配方中補(bǔ)充1mMCaCl2和0.5mMMgCl2。二（實驗原理生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質(zhì)作為配體，并將配體共價結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上。將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合，從而留在固定相上;而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質(zhì)。三（操作程序及結(jié)果判定（一）本實驗室所用的不溶性包涵體的提取方法：1（誘導(dǎo)200mL菌體，4?12000rpm離心1min集菌，然后用PBS洗滌菌體2-3次，用BufferA（一般用1/10體積）重懸菌體，超聲波破碎至清亮,（,?12000rpm離心20min，棄上清，（用,，，洗滌沉淀,，，次,（往沉淀中加,，（,mlBufferA以及19.7ul的DTT（如果是按照上述方法配置的話）及，（,ml,,,的,，，（十二烷基肌氨酸鈉）貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置,，分鐘至，小時（本實驗室一般4?放過夜）,（,?12000rpm離心20min，取上清,(加,，，，，，，，，，，，，ul至終濃度為，(,,，加，，頑(0.03g/mL)的氧化型谷胱甘肽,，，ul至終濃度為,mM,加100mM(0.03g/mL)的還原型谷胱甘肽,，，ul至終濃度為,mM，靜置,，分鐘至，小時(亦可,？復(fù)性過夜)，以1X,,(pH8.0)透析72小時，取出分裝后,8,?保存?zhèn)溆米?A.第一天透析時換液次數(shù)多一些，大概換5次左右，后面兩天的次數(shù)可減少，早中晚各一次。用完之后的透析袋浸泡在20%的無水乙醇中，用時要檢查她是否有液體的滲出，沸水煮5min即可，冷卻后加樣，加樣時要帶手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影響效果。在透析時蛋白濃度太高的話，在透析的過程中會有蛋白的析出，建議在加到透析袋之前做等量體積的稀釋，在透析之后可以用蔗糖處理，即把透析袋平鋪于一干凈的容器中，在上下兩面均用蔗糖鋪蓋，一般在2-3小時左右即可濃縮到一半體積，這個需要本人自行處理決定，但也不能透析時間太長，以免濃度太高，蛋白沾到透析袋上浪費。分裝時如果蛋白較多的話，可以先用500微升EP管，每管裝200微升左右，裝10-20，避免浪費，而且蛋白反復(fù)凍融對其管左右，其他的用1.5ml的EPN管每管兒裝1ml自身的活性影響很大。本實驗室純化GST標(biāo)簽蛋白的方法1.GlutathioneSepharose4B膠的預(yù)處理:取1.33mLGlutathioneSepharose4B膠原液，1800rpm,5min離心去上清B.加入10mL1XPBS，輕搖至GlutathioneSepharose4B膠懸浮于溶液中，1800rpm，5min離心棄上清^加入1mLIXPBS重懸，即可得50%的GlutathioneSepharose4B膠2.洗脫液:0.154g還原性谷胱甘肽溶解于50mL50mmol/LTris-Hcl中，現(xiàn)配用50mmol/LTris-Hcl:0.606gTris-base溶解于足量的蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至8.0后，再加蒸餾水定容至100mL誘導(dǎo)200m1菌體，4?12000rpm1min集菌，然后PBS洗滌誘導(dǎo)后菌體2-3次，1XPBS（一般用1/10體積）重懸菌體，超聲波破碎至清亮，12000rpm，20min離心取上清，在上清中加入適量經(jīng)處理過的50%的GlutathioneSepharose4B膠（一般20ml上清對應(yīng)1ml膠），室溫?fù)u床輕輕晃動令其吸附蛋白1h;2000rpm，5min離心棄上清；加入至少10倍體積PBS，輕搖至GlutathioneSepharose4B膠懸浮于溶液中，2000rpm，5min離心棄上清；重復(fù)步驟5兩次；加入1mLGSTElutionBuffer，輕搖10min;2000rpm，5min離心，收集上清；重復(fù)步驟7-8至少兩次；SDS電泳檢測蛋白純度，紫外分光光度計檢測蛋白濃度；11.將蛋白分裝置于-80?保存。（三）本實驗室純化HIS標(biāo)簽蛋白的方法下面是AKTApurifier全自動層析儀操作規(guī)程，與本實驗室的AKTApurifier儀器型號稍有差別，但基本上大同小異，可做參考。儀器放于F109ELISA工作站的房間中。AKATA全自動層析儀蛋白純化步驟首先是所有溶液都得過濾，超聲波破碎（主要是去除溶液中的氣泡）；開機(jī)（儀器自檢），點開Unicorn，選default,ok（即出現(xiàn)流程圖界面）;首先將A.B探頭都放入20%乙醇中；Mannul，點任意選項，出現(xiàn)操作對話框；Pump flow=1.0，execute，（注意：必須先設(shè)定流速，使其形成通路；即有流速時再作其他操作）。。柱壓基本穩(wěn)定時，洗泵:pump pumpwashpurifier AON，BONexecute;這項儀器自動完成;完成后自動恢復(fù)為上一步的狀態(tài)；一般要平穩(wěn)幾個柱體積，即用乙醇洗20-30ml體積，直至平衡；待平衡時換液（換液時要用蒸餾水洗A.B探頭）：pause，AA液B B液，continue，然后達(dá)到平衡態(tài)；再洗泵:pump pumpwashpurifier AONBONexecute;此時A泵走A液，B泵走B液；待穩(wěn)定下來（平衡時）準(zhǔn)備上樣:將A探頭放入樣品中，并將流速降下來，flow=0.5，execute;樣品上完后，洗脫。準(zhǔn)備接收純化出的蛋白，改流速flow=1.0，gradient，10%B，Execute，然后依次30%B,50%B,100%B（可以根據(jù)洗脫情況自行調(diào)節(jié)）；首先出現(xiàn)的是雜蛋白的峰，可以接收。一般第二個峰是目的蛋白。等峰值開始降下來的時候還可以接，降到線平衡時不再接收，走平時要洗脫15-20ml左右（線走平）才可以調(diào)節(jié)洗脫緩沖液B的濃度；最后走B液（100%濃度），沖洗整個體系;之后，pause，沖洗A.B探頭，將A,B液換為20%乙醇，continue，洗系統(tǒng)，洗泵，步驟同上;洗好后（線平衡）， end，摘下鎳柱；關(guān)閉所有窗口，關(guān)機(jī)。8.實驗室常用的蛋白純化試劑配方：母液:29.22gNacL與2.422gTris-base加入到蒸餾水中，定容至1LBindingbuffer:常用5mM（如果純化之后的蛋白雜帶較多，可以做一個5-40mM的梯度實驗，降低非特異性吸附），在母液中加入0.1702g咪唑，調(diào)pH到7.9并定容至500mL（Elutionbuffer:常用500mM，在母液中加入17.02g咪唑，調(diào)pH到7.9C并定容至500mL注:一般情況下，Bindingbuffer的用量較大，可適當(dāng)調(diào)節(jié)兩者的體積比例。四（注意事項跑膠之后的一些注意事項：a） 膠跑完之后的玻璃板一定要洗干凈，而且不要沾到一塊，凝固之后很難分離下來，分開放置。b） 放30%聚丙烯酰胺的那成冰箱最好不要放其他東西。c） 配完膠的地方清理趕緊。下面我列舉一些從實驗手冊里總結(jié)出來的一部分Tips，僅供參考：A.避免緩沖液中有高