植物病原菌的生物活性成分提取及抑菌活性研究

植物病原菌的生物活性成分提取及抑菌活性研究

高羊茅二級代謝的特點是結(jié)構(gòu)多樣性、功能機制獨特、適應(yīng)性強、適應(yīng)性強、適應(yīng)性強。因此，從高等真菌中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新、活性強的先鋒化合物已成為國際新一代農(nóng)藥開發(fā)的熱點。四川盆地是世界高等真菌物種多樣性最豐富的地區(qū)之一,據(jù)估計有3000~5000種高等真菌。賀新生等通過長期對四川盆地高等真菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)了海綿膠煤炱菌和瑞克纖孔菌等多種高等真菌,但對它們的次生代謝產(chǎn)物及其活性尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究,其活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。為此,筆者以常見的植物病原細(xì)菌姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌、白菜軟腐菌及柑橘潰瘍病菌和病原真菌油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、蘋果腐爛病菌、葡萄黑痘病菌、蘋果斑點落葉病菌、棉花枯萎病菌和番茄棉腐病菌為供試菌株,分別采用牛津杯法和生長速率法對采集自四川的海綿膠煤炱菌、條紋炭角菌、瑞克纖孔菌、木蹄層孔菌、紅緣擬層孔菌、高木蹄層孔菌的乙醇提取物進(jìn)行了抗細(xì)菌和抗真菌活性篩選,旨在為抗細(xì)菌和抗真菌活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及新農(nóng)藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1樹樁及微生物菌種海綿膠煤炱菌(Scoriasspongiosa)野生標(biāo)本采自四川省宜賓市宜賓縣竹林;條紋炭角菌(XylariagrammicaPat.)采自四川省綿陽市涪城區(qū)腐木樹樁;瑞克纖孔菌(Inonotusrickii)采自四川省簡陽市1棵皂莢樹上;木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)、紅緣擬層孔菌(Fomitopsispinicola)、高木蹄層孔菌(Fomesrobustus)均采自四川省臥龍大熊貓自然保護(hù)區(qū)。通過組織分離得到純菌種,標(biāo)本和菌種保存于西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院菌物標(biāo)本室。1.1.2抗菌及微生物病姜瘟病菌(Ralstoniasolanacearum)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae)、白菜軟腐菌(Erwiniacarotovora)、柑橘潰瘍病菌(Xanthomonascitri)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥赤霉病菌(FusariumgraminearumSehw.)、蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamade)、葡萄黑痘病菌(Sphacelomaampelinum)、蘋果斑點落葉病菌(Alternariaalternariaf.spmali)、棉花枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.)Snydei&Handson]、番茄棉腐病菌(PythiumultimumTrow)均由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。1.2方法1.2.1乙醇提取物的制備取海綿膠煤炱菌、條紋炭角菌、瑞克纖孔菌、木蹄層孔菌、紅緣擬層孔菌和高木蹄層孔菌陰干子實體,粉碎。分別稱取10g,用50ml95%乙醇在室溫下浸泡3次,每次2d。合并提取液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑,得各高等真菌的乙醇提取物。用二甲基亞砜(DMSO)將上述高等真菌的乙醇提取物配制成濃度為1mg/ml的溶液,用于體外抗菌活性測定。青霉素鈉配成濃度為500μg/ml的溶液,作為陽性對照。1.2.2抗細(xì)菌活性的測定1.2.2.ph的不同牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,瓊脂15~20g,水1000ml,滅菌前調(diào)pH至7.2~7.4,121℃滅菌30min。將培養(yǎng)基趁熱倒入預(yù)先滅菌過的培養(yǎng)皿內(nèi),平放,冷卻后即成瓊脂平板培養(yǎng)基。1.2.2.培養(yǎng)基的制備將已活化的細(xì)菌菌種用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體放入裝有已滅菌的20ml液體牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中,置于搖床中,37℃恒溫振蕩18~24h備用。1.2.2.抑菌圈直徑測定采用牛津杯法。將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化,按每板25.0ml倒入無菌培養(yǎng)皿中,待平板冷卻后,吸取0.2ml供試植物病原細(xì)菌菌懸液,涂滿整個平板,加蓋放置5min。待平板稍干后,用無菌鑷子將牛津杯直接垂直放在培養(yǎng)基表面,稍微加壓,以便其與培養(yǎng)基接觸無空隙。靜置5min后于牛津杯中無菌加入待測樣品200μl,分別用青霉素鈉和0.5%DMSO作陽性對照和陰性對照,重復(fù)3次。測試樣品加入后再靜置15min,37℃恒溫培養(yǎng)48h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑d(mm),取平均值。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑小于6mm為耐藥;抑菌圈直徑在6~10mm為輕度敏感;抑菌圈直徑在10~14mm為中度敏感;抑菌圈直徑在15~20mm為高度敏感;抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感。1.2.3抗真菌活性的測定1.2.3.冷卻、冷卻PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15~20g,自來水1000ml,自然pH,121℃滅菌20min左右,冷卻后儲存?zhèn)溆谩?.2.3.病原菌生長測定采用生長速率法。取配好的高等真菌提取液1ml加入到19ml已滅菌且冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,無菌操作倒入平板,靜置5min使其冷卻。用滅菌打孔器(直徑6mm)從預(yù)先活化好的7種植物病原真菌平板中按照同心圓打孔,用接種針取打出的菌絲圓片接入到制備好的培養(yǎng)基平板中心,使菌片帶菌絲的一面向下,貼在培養(yǎng)基表面。每種測試樣品液3次重復(fù),以不加測試樣品液的培養(yǎng)基平板作為空白對照。接種后的培養(yǎng)皿于28℃恒溫培養(yǎng)。每24h觀察一次,根據(jù)空白對照培養(yǎng)皿中菌絲的生長情況調(diào)查病原菌菌絲生長情況,待對照組的菌絲長滿平皿時,用十字交叉法垂直測量供試菌菌落生長直徑各1次,取平均值。用下述公式計算抑制率:純生長量=菌落平均直徑-菌絲圓片直徑抑制率(%)=(空白對照菌落純生長量-處理菌落純生長量)/空白對照菌落純生長量×1002結(jié)果與分析2.16抑菌圈和抗菌活性測定由表1可知,海綿膠煤炱菌乙醇提取物和木蹄層孔菌乙醇提取物對4種供試菌株都有抗菌活性,且抑菌圈直徑都大于10mm,敏感性較強,其中木蹄層孔菌對白菜軟腐病菌的抑菌圈直徑為17.2mm,與作為陽性對照的青霉素鈉抑菌圈直徑很接近,表現(xiàn)出高度敏感。條紋炭角菌、瑞克纖孔菌和紅緣擬層孔菌的乙醇提取物除了對柑橘潰瘍病菌無抗菌活性外,對其他3種供試菌株均有活性,其中瑞克纖孔菌乙醇提取物對姜瘟病菌的抑菌直徑為20.2mm,對白菜軟腐病菌的抑菌圈直徑為19.0mm,這與作為陽性對照的青霉素鈉的抑菌圈直徑極為接近,說明瑞克纖孔菌對姜瘟病菌和白菜軟腐病菌的抗菌活性為高度敏感;紅緣擬層孔菌乙醇提取物對姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌和白菜軟腐病菌的抗菌活性也表現(xiàn)出高度敏感,抑菌圈直徑分別為18.5、16.9和17.4mm。高木蹄層孔菌乙醇提取物對水稻白葉枯病菌、白菜軟腐病菌和柑橘潰瘍病菌也表現(xiàn)出抗菌活性。2.26抑菌活性測試由表2可知,瑞克纖孔菌和條紋炭角菌的乙醇提取物對7種病原真菌都有抑制活性,且抑制率較高,瑞克纖孔菌乙醇提取物對油菜菌核病菌的抑制率達(dá)80.6%,對蘋果腐爛病菌的抑制率達(dá)78.4%;條紋炭角菌乙醇提取物對蘋果腐爛病菌的抑制率達(dá)84.9%,對油菜菌核病菌的抑制率達(dá)76.8%。木蹄層孔菌乙醇提取物除了對油菜菌核病菌和小麥赤霉病菌的抑菌活性未測試外,對其余5種病原真菌都有一定的抑制活性,對番茄棉腐病菌的抑制率達(dá)70.3%。高木蹄層孔菌乙醇提取物對葡萄黑痘病菌無抑制作用,但對蘋果斑點落葉病菌的抑制率達(dá)70.6%。紅緣擬層孔菌乙醇提取物對小麥赤霉病菌、蘋果腐爛病菌、葡萄黑痘病菌、棉花枯萎病菌和番茄綿腐病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制效應(yīng)。海綿膠煤炱菌乙醇提取物對測試的5種病原真菌均無抑制活性。3不同高等真菌的抗菌活性該研究選用常見的4種植物病原細(xì)菌和7種植物病原真菌作為測試對象,研究了海綿膠煤炱菌、條紋炭角菌、瑞克纖孔菌、木蹄層孔菌、紅緣擬層孔菌和高木蹄層孔菌的乙醇提取物的抗菌活性,結(jié)果表明該6種高等真菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性。但對于不同的病原細(xì)菌和病原真菌,不同高等真菌乙醇提取物的抗菌活性表現(xiàn)出一定的差異和選擇性。6種高等真菌對水稻白葉枯病菌和白菜軟腐病菌都有抑制活性;除了高木蹄層孔菌外,其他5種真菌對姜瘟病菌都有抗菌活性;海綿膠煤炱菌、木蹄層孔菌和高木蹄層孔菌對柑橘潰瘍病菌都有抗菌活性;瑞克纖孔菌和條紋炭角菌乙醇提取物對7種病原真菌都有抑制活性,木蹄層孔菌、高木蹄層孔