不同地理分布及抗寒性的繡線菊抗寒力研究

不同地理分布及抗寒性的繡線菊抗寒力研究

繡菊屬植物具有適應性強、觀賞價值高的特點。如果該項目的利用，可以彌補北方寒冷地區(qū)綠化材料的不足（劉惠民等，2010）。在各種環(huán)境脅迫中,低溫對植物的影響尤為突出(Ameglioetal.,2003;李秀芬等,2013),對植物最大凈光合速率、光補償點、光飽和點均產(chǎn)生影響,說明光合能力與抗寒能力間有一定關系(Damian&Donald,2001)。植物的抗寒性與其質(zhì)膜透性(Lyons,1970)、膜脂肪酸種類與含量(王孝宣等,1997)、ABA含量(龔月樺等,2006)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與保護酶系統(tǒng)等均顯著相關(Thomas&James,1993;Gusta,1994;楊春祥等,2005;相昆等,2011)。植物的半致死溫度(LT50)能準確反映其抗寒能力,可作為評價抗寒力的穩(wěn)定指標(Lu&Mark,1990;趙昌瓊等,2003;徐康等,2005;Azzarelloetal.,2009;Liuetal.,2012)。隸屬函數(shù)法是目前普遍采用的抗性綜合評價方法(王連翠,2007;張文娥等,2007)。本試驗中以觀賞價值較高的18種繡線菊為研究材料,通過測定露地自然低溫與人工低溫脅迫處理下的相關生理指標,擬合隸屬函數(shù)模型,以Logistic方程得出抗寒生理指標隸屬函數(shù)值和半致死溫度,結合田間調(diào)查,對其抗寒能力作出評價,為其應用于北方高寒地區(qū)的園林綠化提供依據(jù)。1材料和方法1.1不同繡線菊的低溫處理試驗試驗材料來源于黑龍江省哈爾濱市森林植物園繡線菊資源圃(表1),引種到東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院設施工程中心。采用2年生實生苗,用普通園土缽(13cm×13cm)栽于露地,每缽土壤500g,每種繡線菊試驗材料各栽植200缽,隨機分成4組,每組50缽,其中2組用于露地自然低溫、2組用于冰凍試驗處理。試驗材料常規(guī)管理。當缽苗生長高度達20~30cm、分枝數(shù)量達8~10條、葉片數(shù)達30枚以上時,對各繡線菊缽苗進行低溫處理。取樣時在每組試驗材料中按照對角線法隨機采集位于中上部的當年生枝條上第3~8片生長最佳葉片(零上低溫處理時)或當年生枝條中段(零下低溫處理時),分別采集12~16g葉片或枝條,液氮迅速處理保存于–80℃冰箱待測。各處理試驗材料采用3次重復隨機取樣、平行樣測定,測定結果取平均值。1.2復合光譜分析于2011年秋季9月上旬露地平均溫度達15℃,9月中下旬晝夜自然溫度分別降到5和0℃,10月上中旬分別達–5和–15℃時開始,1周后各取樣1次,測定光合生理指標(僅在零上低溫取樣)、質(zhì)膜透性、膜脂肪酸種類與含量、ABA含量、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量與保護酶活性等生理指標(Garaham&Pattem,1982;Verruggen&Hermans,2008),期間露地晝夜自然平均光照為860~1100μmol·m-2·s-1。最大凈光合速率(Pn,max)、光補償點(LCP)、光飽和點(LSP)測定采用光響應曲線法(樊超,2008)。于晴朗微風天氣9:00—11:30測定,采用開放氣路,空氣流速0.5L·min-1,葉室溫度10~19℃,相對濕度50%~55%,CO2濃度360μmol·L-1。利用人工光源依次設定光合有效輻射(PAR)為0、30、50、100、300、500、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200μmol·m-2·s-1的光照梯度,選取各繡線菊植株中上部生長良好的葉片測定。利用Origin7.02軟件擬合繪制光響應曲線,光響應曲線利用非線性方程進行擬合(Murray,1977)。膜脂肪酸含量與種類測定采用氣相色譜外標法(劉慧民等,2011)。稱取5g試驗材料(零上低溫時取當年生枝條先端第3~8枚葉片,零下低溫時取當年生枝條中段),經(jīng)研磨、提取、過濾、吹干、定量等處理后進行氣相色譜分析:ShimadzaGC-2010氣相色譜儀,中等極性色譜柱30QC2/AC10,30.0cm×0.22mm(內(nèi)徑),薄膜厚度0.25μm,柱溫200℃,載氣N2,分流比1︰10,FID檢測器溫度250℃。據(jù)測定結果分析各繡線菊膜脂中脂肪酸種類與含量,計算脂肪酸不飽和指數(shù)。ABA含量測定參照酶聯(lián)免疫法(ELISA)(吳頌如等,1988)。稱取0.25g試驗材料,冰浴研磨提取過夜,室溫4000r·min-1離心15min后取上清液。上清液經(jīng)C18預處理小柱過柱純化,純化濾液40℃水浴氮氣吹干,加稀釋液溶解待試劑盒測定。SOD酶活性測定采用NBT還原法(李合生,2006)。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸)生理指標測定采用比色法(李合生,2000)。運用隸屬函數(shù)法計算各繡線菊抗寒隸屬函數(shù)值。每種繡線菊的各種生理指標的隸屬值累加,取其平均數(shù)以評定其抗寒性。公式:R(Xi)=(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin),式中Xi為某項指標測定值,Xmin、Xmax為所有參試材料中該項指標的最小值和最大值;如某一指標與抗寒力負相關用反隸屬函數(shù)計算,公式:R(Xi)=1–(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。本試驗中分別計算每種繡線菊葉片生理指標隸屬函數(shù)值和枝條生理指標隸屬函數(shù)值,得出它們的平均隸屬函數(shù)值作為每種繡線菊的抗寒隸屬函數(shù)值。1.3相對電導率測定在露地晝夜自然平均溫度分別達–15、–20和–25℃時3d后取樣;同時在冰箱內(nèi)分別人工設定不同的晝溫夜溫,使晝夜均溫為–30、–35和–40℃(因露地晝夜平均溫度未能達到–30℃及以下),將露地中經(jīng)上述低溫冰凍的材料整缽放于干凈塑料袋中封裝后轉(zhuǎn)入低溫冰箱冰凍,每級溫度處理3d后取樣。各樣品取枝條中段采用DDS-11型電導儀法測定相對電導率,通過擬合Logistic方程y=k/(1+ae-bt)計算各繡線菊半致死溫度(LT50),式中y代表相對電導率,t代表處理溫度,k為細胞傷害率飽和容量,a,b為方程參數(shù)(Rajashekaretal.,1979;Longford,1994;王微,2009)。根據(jù)不同溫度下的電導率值,通過直線回歸方法求得a,b值及相關系數(shù)r。曲線拐點x=(lna)/b,即為半致死溫度(朱根海等,1986)。采用改進的數(shù)學分析方法(k=100)求得拐點溫度(高爾謙和宋長冰,1997)。1.4種繡線菊各生理指標與抗寒性間的關聯(lián)度為評價18種繡線菊各抗寒生理指標與抗寒性間的關系,對18種繡線菊的9個生理指標進行灰色關聯(lián)分析,將18種繡線菊的9個生理指標視為一個灰色系統(tǒng),以相對電導率為參考數(shù)列(母序列),9個生理指標為比較數(shù)列(子序列)計算各生理指標與抗寒性間的關聯(lián)系數(shù)(吳麗麗等,2010),求得灰色關聯(lián)度(張超,2008)。1.5抗寒性對繡線菊越冬能力的影響根據(jù)各繡線菊上述抗寒生理指標隸屬函數(shù)值和半致死溫度,篩選抗寒性強與抗寒性弱的繡線菊種類,對篩選出的抗寒與不抗寒繡線菊種類,于次年春季再分別進行田間露地越冬調(diào)查,以枝條凍梢數(shù)量百分率與枝條凍梢長度百分率、枝條萌芽率與展葉時間等形態(tài)生長指標評價各繡線菊越冬能力(Guy,1990)。2結果與分析2.1繡線菊抗逆性生物指標檢測試驗中得出18種(品種)繡線菊的抗寒生理指標值(表1)。每種繡線菊平均隸屬函數(shù)值(表2)分別由其可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量(Coteetal.,1989)、SOD酶活性(Nordinetal.,1991)、ABA含量、膜脂肪酸不飽和指數(shù)(Xin&Browse,2000)、光合生理指標(Pn,max、LCP、LSP)的隸屬函數(shù)值加權平均后取得(劉慧民,2013)。研究認為越抗寒的種類其隸屬函數(shù)值越大。本試驗中各繡線菊抗寒平均隸屬函數(shù)值范圍在0.254~0.613之間,其中隸屬函數(shù)值超過0.600的繡線菊僅有華北繡線菊和土莊繡線菊;隸屬函數(shù)值在0.400~0.600之間的有絨毛繡線菊、石蠶葉繡線菊、絹毛繡線菊、金絲桃葉繡線菊和三裂繡線菊;說明這7種繡線菊抗寒力強于其它11種。2.2光皮之間半致死溫度比較由表3數(shù)據(jù)分析,繡線菊枝條的電導率隨溫度降低逐漸升高,但不同種間上升幅度并不一致。18種繡線菊半致死溫度擬合曲線方程的相關系數(shù)均在0.900以上,說明半致死溫度與Logistic方程相關性高,數(shù)據(jù)可靠。各繡線菊半致死溫度范圍在–19.8~–32.6℃之間,其中半致死溫度超過–30℃的有華北繡線菊、土莊繡線菊、絨毛繡線菊和石蠶葉繡線菊4種;在–25~–30℃之間的有8種;在–20~–25℃之間的有5種;–20℃以上的僅有曲萼繡線菊1種。根據(jù)黑龍江省域歷年溫度分布情況,能耐受–27℃以下低溫的繡線菊,基本可以在黑龍江省中部和北部地區(qū)露地應用,因此認為華北繡線菊、土莊繡線菊、絨毛繡線菊、毛果繡線菊、絹毛繡線菊、三裂繡線菊、金絲桃葉繡線菊和石蠶葉繡線菊等8種抗寒力較強,可以在黑龍江省高寒地域露地應用。2.3各因素相關趨勢越為評價18種繡線菊各抗寒生理指標與抗寒性間的關系,對9個生理指標(表1)進行灰色關聯(lián)分析?；疑P聯(lián)分析是對一個相互關聯(lián)的系統(tǒng)關系變化的量化比較,關聯(lián)度反映關聯(lián)程度的量度,關聯(lián)度越大說明系統(tǒng)內(nèi)各因素間相關趨勢越接近(趙天宏等,2003;李建武和王蒂,2008)。由表4數(shù)據(jù)分析,18種繡線菊各生理指標與抗寒性間的關聯(lián)度范圍在0.39~1.31之間。方差分析表明,各生理指標與抗寒性的關聯(lián)度之間多數(shù)差異顯著,其中可溶性糖的關聯(lián)度最大為1.31,各生理指標按關聯(lián)度大小排序為可溶性糖>膜脂肪酸不飽和指數(shù)>ABA>光補償點>最大凈光合速率>光飽和點>可溶性蛋白>SOD酶活性>脯氨酸。各抗寒生理指標與其抗寒性的關聯(lián)度在0.3以上,說明與繡線菊抗寒性有一定的相關性(胡尚連等,2010)。2.4主要繡線菊抗寒力特點根據(jù)表5數(shù)據(jù),參照張文娥等(2007)的方法依據(jù)隸屬函數(shù)值對各繡線菊抗寒分類:華北與土莊繡線菊隸屬函數(shù)值在0.60~0.69間,為抗性種類(Resistance,R),抗寒性Ⅱ級;絨毛、石蠶葉、絹毛、金絲桃葉和三裂繡線菊隸屬函數(shù)值在0.40~0.59間,為中抗種類(MiddleResistance,MR),抗寒性Ⅲ級;‘金山’、毛果、石棒、‘金焰’、柳葉、楔葉和珍珠繡線菊隸屬函數(shù)值在0.30~0.39間,為低抗種類(LowerResistance,LR),抗寒性Ⅳ級;粉花、耬斗菜葉、美麗和曲萼繡線菊隸屬函數(shù)值在0~0.29間,為不抗種類(Susceptible,S),抗寒性Ⅴ級。華北、土莊、絨毛、石蠶葉、絹毛、金絲桃葉6種繡線菊的半致死溫度在–28~–32.6℃間,抗寒力強,可在黑龍江省北部高寒地區(qū)露地應用(該區(qū)域冬季平均溫度為–31.3℃);三裂、毛果、石棒、柳葉4種繡線菊的半致死溫度在–26~–27.5℃間,抗寒力較強,可在黑龍江省中部地區(qū)露地應用(該區(qū)域冬季平均溫度為–26℃);楔葉、珍珠、粉花、耬斗菜葉、‘金焰’5種繡線菊的半致死溫度在–23~–25.5℃間,抗寒力中等,可在黑龍江省南部地區(qū)露地應用(該區(qū)域冬季平均溫度為–24℃);‘金山’、美麗、曲萼3種繡線菊的半致死溫度在–19~–20.7℃間,抗寒力弱,不適合在黑龍江地區(qū)露地應用。根據(jù)18種繡線菊的半致死溫度和平均隸屬值綜合分析,并結合各繡線菊露地越冬表現(xiàn)進行篩選(劉慧民,2013),華北繡線菊、土莊繡線菊(抗寒性Ⅱ級)、絨毛繡線菊、石蠶葉繡線菊、絹毛繡線菊、金絲桃葉繡線菊、三裂繡線菊(抗寒性Ⅲ級)抗寒力最強;毛果繡線菊、石棒繡線菊、柳葉繡線菊(抗寒性Ⅳ級)抗寒力較強。3基于隸屬函數(shù)的抗寒力綜合評價本試驗中模擬隸屬函數(shù)模型和擬合Logistic方程,計算各繡線菊抗寒生理指標隸屬函數(shù)值和半致死溫度,據(jù)此評價并篩選抗寒繡線菊資源。繡線菊抗寒評價與篩選方法的可靠性:植物抗性是多因素影響的綜合性數(shù)量性狀,對植物的抗性評價應從形態(tài)、生理生化等指標中篩選有顯著影響的若干主要指標(景憶蓮等,1999)。為評價18種繡線菊的抗寒性并篩選抗寒資源,選擇了與繡線菊抗寒性關聯(lián)度在0.39~1.31間的可溶性糖、膜脂肪酸不飽和指數(shù)、ABA、光補償點等9個生理生化指標,以減少單一指標造成的片面性和不準確,使評價結果更具科學性;隸屬函數(shù)法和半致死溫度是普遍采用的抗性綜合評價方法,田治國等(2011)通過測定16個抗旱生理指標,應用隸屬函數(shù)法對9個萬壽菊品種的抗旱性進行綜合評價和篩選。趙昌瓊等(2003)、徐康等(2005)以Logistic方程計算茶梅半致死溫度,作為評價茶梅抗寒力的重要依據(jù);目前這兩種方法已廣泛用于大麥、銀杏、辣椒和偃麥草等植物的抗逆評價,本研究中按抗寒生理指標隸屬函數(shù)值將18種繡線菊抗寒力分為5級,并結合它們的半致死溫度,評價與篩選抗寒繡線菊資源,具有雙重依據(jù)和可靠性。繡線菊抗寒評價和篩選與繡線菊露地越冬表現(xiàn)的一致性:據(jù)高愛農(nóng)等(2000)和張文娥等(2007)用經(jīng)典方法對繡線菊抗寒分級,18種繡線菊種間抗寒能力有一定差別(表5)。半致死溫度是衡量植物抗寒力的穩(wěn)定指標(Liuetal.,2012),據(jù)各繡線菊半致死溫度和黑龍江省歷年溫度分布情況(中國氣象科學數(shù)據(jù)共享服務網(wǎng)),給出了各繡線菊的不同應用區(qū)域(表5)。分別按隸屬函數(shù)值和半致死溫度,各繡線菊抗寒能力排序比較一致(表5),前7種繡線菊及第17、18種繡線菊的抗寒力排序完全一致,毛果、石棒、柳葉、楔葉、珍珠、粉花、耬斗菜葉7種繡線菊的排序僅差1位或2位,僅‘金山’、‘金焰’繡線菊抗寒順序明顯不同,‘金山’繡線菊抗寒力排序分別為第8、16位,‘金焰’繡線菊抗