神經(jīng)源性膀胱尿動力學(xué)變化及p2y4的表達(dá)意義

神經(jīng)源性膀胱尿動力學(xué)變化及p2y4的表達(dá)意義

脊柱損傷會導(dǎo)致高級神經(jīng)中樞失去對損傷平面和以下內(nèi)臟器官的調(diào)節(jié)和支配，導(dǎo)致神經(jīng)器官功能障礙。這是神經(jīng)起源性膀胱最常見的原因之一。但其發(fā)病機制尚不完全清楚。作為細(xì)胞內(nèi)能量庫的三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)在組織損傷被分泌釋放到細(xì)胞外時,可作用于細(xì)胞表面P2嘌呤受體(包括P2X、P2Y受體家族),發(fā)揮遞質(zhì)作用。P2Y4受體是BOEYNAEMS等于1996年發(fā)現(xiàn)并將其克隆。本研究擬采用免疫組化技術(shù),檢測P2Y4受體在大鼠神經(jīng)源性膀胱逼尿肌中的表達(dá)水平,結(jié)合尿動力學(xué)檢查結(jié)果,分析P2Y4受體與膀胱尿道功能障礙之間的相關(guān)性。探討P2Y4表達(dá)與神經(jīng)源膀胱發(fā)病機制的關(guān)系。1硬脊膜的開孔與毒性1.1建立實驗動物模型健康成年SD大鼠50只,雌雄不限,體重180-220g,,隨機分為對照組10只、骶上脊髓損傷組20只、骶髓損傷組20只,均購自于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。橫斷骶髄上脊髓模型:10%水合氯醛(CH,0.03mL/kg)腹腔麻醉。背部備皮后,以第13胸椎作為標(biāo)志縱行切開皮膚約1.5cm,分離皮下,無菌手術(shù)刀片緊貼棘突骨兩側(cè),行椎旁肌縱行切開,止血鉗咬除L2-L3椎板至橫突根部,于L2-L3處打開硬脊膜,以刀片快速橫斷脊髓。充分止血,逐層關(guān)閉。術(shù)后腹腔內(nèi)注射慶大霉素5500U/kg,1次/d,連續(xù)10d。骶髓損傷組模型分離背肌至S1-S2,脊突,椎板。咬除L7-S1脊突和椎板。暴露硬脊膜,以手術(shù)刀片橫斷硬脊膜和脊髓,充分止血,逐層關(guān)閉。對照組模型依次切開皮膚皮下,顯露硬脊膜后不做處理,之后關(guān)閉各層。各組大鼠均單籠飼養(yǎng)。每日4次采用Crede手法在膀胱體表部位擠壓膀胱協(xié)助其排尿排便。1.2尿動力學(xué)檢測水合氯醛0.03mL/kg腹腔麻醉,在膀胱體表部位切開皮膚找到膀胱。將測壓導(dǎo)管相接的硬膜外導(dǎo)管從膀胱頂插入。使用三通管與Sirius8000尿動力儀(德國)相連,另一端與微量灌注泵相連。記錄膀胱壓力變化與灌注量之間的關(guān)系,記錄膀胱最大容積。1.3主要試劑兔抗鼠P2Y4多克隆抗體,羊抗鼠IgG二抗購于博奧森生物科技公司。DAPI購自上海碧云天公司,抗體稀釋液購自武漢博士德生物工程有限公司。標(biāo)本經(jīng)石蠟切片厚5μm.免疫組化法采用SP法.P2Y4一抗?jié)舛?:100,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,均數(shù)比較采用t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.01有顯著性差異。2對大鼠使用時長的影響動物脊髓橫斷后死亡率較高。24h內(nèi),骶上脊髓損傷組死亡4只,骶下脊髓損傷組死亡6只,主要原因可能是術(shù)后感染,腸梗阻,尿潴留所致。膀胱順應(yīng)性、膀胱最大容量在骶上脊髓損傷組中,較對照組、骶髓損傷組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);膀胱順應(yīng)性、膀胱最大容量在骶髓損傷組中,較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。逼尿肌漏尿點壓在骶髓損傷組中,較對照組下降明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在骶上脊髓損傷組中,逼尿肌漏尿點壓比骶髓損傷組、對照組升高明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見附表)。P2Y4在各組大鼠逼尿肌中均有陽性表達(dá)。對照組表達(dá)位點數(shù)為(7.8902±0.3609);骶髓損傷組(3.9895±0.2197);骶上脊髓損傷組為(16.4186±0.4718)。骶上脊髓損傷組明顯較對照組、骶髓損傷組增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);骶髄損傷組較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3p2py4受體與髓胞損傷的關(guān)系膀胱的正常功能依賴于自主神經(jīng)與軀體神經(jīng)的感覺及運動成分間的相互協(xié)調(diào)?？刂婆拍蚬δ艿闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)受到損害而引起的膀胱功能障礙稱為神經(jīng)源性膀胱。神經(jīng)源性膀胱作為泌尿外科常見疾病,嚴(yán)重?fù)p害患者健康。目前,我國脊髓損傷主要致死因素為上尿路功能損害,在致死因素中占43%-75%。膀胱尿道功能障礙是脊髓損傷上尿路功能損害的直接原因之一。因此嚴(yán)重影響病人的身體健康和生活質(zhì)量。針對膀胱功能障礙患者而言,其病情轉(zhuǎn)歸除自然恢復(fù)因素,更重要的是與患者一般狀況、所采取的治療措施密切相關(guān)。尿動力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn),脊髓休克期后,實驗大鼠的膀胱順應(yīng)性、膀胱最大容量在骶上脊髓損傷組中,較對照組、骶髓損傷組顯著下降(P<0.01);膀胱順應(yīng)性、膀胱最大容量在骶髓損傷組中,較對照組顯著增加(P<0.01)。逼尿肌漏尿點壓力在骶上脊髓損傷組中,較對照組、骶髓損傷組明顯升高(P<0.01),逼尿肌漏尿點壓力在骶髓損傷組較對照組顯著降低(P<0.01)。本實驗表明,P2Y4受體在骶髓損傷組中,大鼠膀胱逼尿肌中的表達(dá)水平較對照組、骶上脊髓損傷組顯著降低;P2Y4受體在骶上脊髓損傷組,大鼠膀胱逼尿肌中的表達(dá)水平較對照組顯著增高。說明在逼尿肌中,P2Y4受體的表達(dá)水平與不同平面脊髓損傷密切相關(guān)。MALIN等研究發(fā)現(xiàn),對大鼠P2Y4受體基因被敲除后,大鼠膀胱排尿反射功能表現(xiàn)出明顯的膀胱反射功能減弱、排尿次數(shù)減少、膀胱容量增加。以上研究結(jié)果均提示,P2Y4受體表達(dá)水平與膀胱尿道功能障礙程度密切相關(guān)。NILSON等研究認(rèn)為,在破壞脊髓上通路后機體仍然存在多個ATP釋放源,如脊髓傳入神經(jīng)末梢中間神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等,然而不論ATP是何種起源釋放的,相關(guān)研究都清楚表明慢性脊髓損傷時中樞嘌呤反應(yīng)增強。針對神經(jīng)源性膀胱尿道功能障礙,目前治療尚無統(tǒng)一方案。治療目的與實際可行性亦因人而異。脊髓損傷后,解決膀胱尿道功能障礙仍然是醫(yī)學(xué)難題。當(dāng)前,在臨床上對于脊髓損傷后的神經(jīng)康復(fù)治療尚無重大進(jìn)展,采用神經(jīng)調(diào)節(jié)方法治療神經(jīng)源性膀胱功能障礙的效果不理想。本