炮制時(shí)間對制烏頭中5種化學(xué)成分的影響

炮制時(shí)間對制烏頭中5種化學(xué)成分的影響

何首烏最初出現(xiàn)在開寶草本植物中。這是蓼科植物的干燥部位。它可以解毒、消除邪氣、潤腸排便。產(chǎn)品具有補(bǔ)肝、腎、精血、烏須發(fā)等功效?！吨袊幍洹泛汀度珖兴幣谥埔?guī)范》對何首烏炮制時(shí)間未做明確規(guī)定,課題組采用大鼠血虛動物模型,證明采用傳統(tǒng)方法炮制24,32,40h的炮制品醇提液顯示一定的補(bǔ)血功效,生首烏和72h炮制品醇提液則未顯示出補(bǔ)血功效。何首烏主要含2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)、游離蒽醌(如大黃素與大黃素甲醚)等,是目前何首烏質(zhì)量控制的主要成分,在2010年版《中國藥典》中均有含量測定要求。此外,近幾年研究發(fā)現(xiàn),何首烏經(jīng)炮制后可檢測到?jīng)]食子酸、5-羥甲基糠醛(5-HMF)等成分,但是否與其炮制后藥效變化相關(guān)尚不明確,目前仍缺乏制何首烏飲片有效的質(zhì)量控制方法。本文采用RP-HPLC法建立制何首烏中沒食子酸、5-羥甲基糠(5-HMF)、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素與大黃素甲醚的含量測定方法,分析生首烏及其24,32,40,72h的炮制品5種成分的含量變化規(guī)律,結(jié)合前期藥效研究結(jié)果,為進(jìn)一步研究制何首烏飲片質(zhì)量控制方法提供參考。1材料表面1.1高效液相色譜檢測美國Agilent1200型高效液相色譜儀(含在線真空脫氣機(jī),高壓四元泵,自動進(jìn)樣器,智能化柱溫箱,二極管陣列檢測器DAD,Agilent1200series色譜工作站;BS224S電子分析天平(Sartorius);USC-702超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司);G20型醫(yī)用高速離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠);minipore純水機(jī)1.2藥品、試劑與儀器沒食子酸對照品(批號110831-200302)、5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品(批號111626-200402)、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號110844-200505)、大黃素對照品(批號0756-9707)與大黃素甲醚對照品(批號110758-200509)均購自中國藥品生物制品檢定所;其余所用試劑均為色譜純,水為超純水。何首烏飲片生品(批號050402)由廣東省康美飲片廠提供,產(chǎn)地為廣東德慶,原藥材經(jīng)該廠質(zhì)檢部鑒定為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb的塊根。制首烏飲片由本實(shí)驗(yàn)室人員在康美飲片廠炮制,采用傳統(tǒng)炮制方法,將潤透后的生藥置籠屜蒸,分別蒸制24,32,40,72h,低溫烘干。2方法和結(jié)果2.1檢測波長和方法色譜柱為PhenomenexKinetexTMC18(4.6mm×100mm,2.6μm);流動相A為乙腈,B為0.5%乙酸,梯度洗脫(0~7min,2%~3%A,98%~97%B;7~18min,3%~28%A,97%~72%B;18~24min,28%~55%A,72%~45%B;24~36min,55%~95%A,45%~5%B);流速1.8mL·min-1,柱溫30℃,DAD全波長掃描范圍為190~400nm,檢測波長沒食子酸270nm、5-HMF284nm、二苯乙烯苷320nm、大黃素和大黃素甲醚254nm;進(jìn)樣量5μL。對照品與供試品色譜圖分別見圖1,2。2.2對照品溶液的配制分別精密稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷與大黃素對照品適量,置于100mL量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別配制成117.0,107.0,107.0,123.0mg·L-1對照品溶液;精密稱取大黃素甲醚對照品適量,置于100mL量瓶中,加80%甲醇適量,超聲10min,超聲后冷卻至室溫,80%甲醇補(bǔ)足至刻度,搖勻,精密移取2.87mL置于10mL量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,配制成33.84mg·L-1大黃素甲醚對照品溶液。2.3供試品溶液的制備取制何首烏細(xì)粉約0.25g,精密稱定,置于100mL量瓶中,加入80%甲醇適量,靜置30min后,超聲提取20min,超聲后冷卻至室溫,80%甲醇補(bǔ)足至刻度,搖勻,10000r·min-1離心3min,吸取上清液,0.22μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液為供試品溶液。2.4高效液相色譜法精密移取5種對照品溶液,分別用80%甲醇配制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度,見表1,按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別取系列質(zhì)量濃度的沒食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品溶液注入高效液相色譜儀,測定峰面積值;由于所考察的對照品溶液線性范圍較廣,采取以對照品溶液濃度(mg·L-1)為自變量(X),色譜峰面積為因變量(Y),利用Excel數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行最小二乘法回歸分析,得到斜率與截距,其回歸方程式與相關(guān)系數(shù)(r)如表2所示,5個(gè)成分均呈良好線性關(guān)系。2.5儀器精密度試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別取沒食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黃素與大黃素甲醚對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,測定并計(jì)算5種成分峰面積值RSD分別為1.45%,0.42%,0.34%,0.92%,1.45%,表明儀器精密度良好。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件,取同一供試品溶液,分別在制備后的2,4,6,8,12,24h注入高效液相色譜儀,測定5種成分峰面積RSD分別為1.64%,0.63%,0.52%,0.74%,1.25%,表明供試品溶液中5種成分在24h之內(nèi)保持穩(wěn)定。2.7重復(fù)性試驗(yàn)的考察取同一批次何首烏樣品6份,每份約0.25g,精密稱定,分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算沒食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黃素與大黃素甲醚的含量,RSD分別為0.58%,0.68%,0.46%,0.37%,0.15%(n=6),表明該法重復(fù)性良好。2.8對照品溶液制備稱取已知5種成分含量的制何首烏飲片細(xì)粉約0.25g,精密稱定。另取5種對照品用80%甲醇配制成低、中、高3種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,分別含沒食子酸32.33,40.42,55.50mg·L-1;5-HMF7.800,8.520,11.10mg·L-1;二苯乙烯苷146.0,220.9,419.8mg·L-1;大黃素31.82,45.46,78.84mg·L-1;大黃素甲醚8.920,17.44,23.16mg·L-1。精密移取混合對照品溶液10mL加至樣品中,各成分對照品加入量與樣品中的含量比例約為1∶1。按照2.3項(xiàng)下方法制備,每個(gè)濃度平行操作3份。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測定5種成分含量,并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表3。2.9測定總成成元含量的測定取1.2項(xiàng)下何首烏和制何首烏各樣品細(xì)粉約0.5g,精密稱定,按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測定5種成分的含量,測定結(jié)果分別見表4。3討論3.1提取效率的提高比較了兩種提取方法的提取效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%甲醇超聲提取20min所得5種成分含量較高(沒食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黃素與大黃素甲醚含量分別為0.1543%,0.03752%,1.932%,0.1849%,0.05668%),大于80%乙醇回流提取2h得到的含量(含量分別為0.1309%,0.03763%,1.523%,0.09052%,0.02773%),效率顯著提高。3.2回收率及色譜條件應(yīng)用了具有超高效、低背壓性能的新型色譜柱,采用1.8mL·min-1的流速,檢測時(shí)間36min,比常規(guī)C18色譜柱(約需70min)大大節(jié)省分析時(shí)間,從而顯著提高了分析效率,且結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性良好,也為(制)何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了一種快捷的分析方法。3.33號峰的評估3.4樣品的制備及檢測何首烏所含的鞣質(zhì)類物質(zhì)經(jīng)加熱后水解,制首烏中沒食子酸的含量比生首烏顯著升高,但炮制至24h后,其含量變化較為穩(wěn)定;5-HMF為炮制后新產(chǎn)生的成分,其含量隨著炮制時(shí)間的延長而增加;大黃素和大黃素甲醚炮制后含量升高,以32h炮制品含量最高,之后則呈現(xiàn)下降的趨勢;二苯乙烯苷的含量則隨著炮制時(shí)間的延長呈下降趨勢,按照2010年版《中國藥典》規(guī)定,制首烏二苯乙烯苷含量應(yīng)不低于0.7%,即7mg·g-1,本實(shí)驗(yàn)按傳統(tǒng)炮制方法清蒸32,40,72h樣品的二苯乙烯苷含量均低于0.7%,而前期的藥效學(xué)研究表明,24,32,40h的制首烏均有改善大鼠貧血模型指標(biāo)的作用。因此,制首烏補(bǔ)血功效與其主要化學(xué)成分之間的相關(guān)性及量效關(guān)系有待進(jìn)一步深入的研究。采用乙腈-0.5%乙酸體系進(jìn)行梯度洗脫,所測5種成分得到有效的分離,采用LC-MS(ThermoScientificLTQOrb