遺傳學(xué)教學(xué)課件：09 第九章 分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用一、標(biāo)記的發(fā)展1、形態(tài)學(xué)標(biāo)記形態(tài)學(xué)標(biāo)記主要指那些可遺傳的外觀性狀，如株高、穗形、粒色、花色、芒或茸毛有無等。孟德爾利用豌豆的形態(tài)標(biāo)記推導(dǎo)出遺傳因子的分離和自由組合規(guī)律，摩爾根利用果蠅的形態(tài)與細(xì)胞學(xué)標(biāo)記進(jìn)一步闡述了基因的連鎖和互換規(guī)律。2、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。染色體的結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征是常見的細(xì)胞學(xué)特征，他們分別反應(yīng)了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，但這些標(biāo)記材料的產(chǎn)生需要花費(fèi)大量的人力物力，有些物種對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變異的耐受性較差，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料。有些物種雖然已經(jīng)有細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料，但這些標(biāo)記常常伴有對(duì)生物有害的表型效應(yīng)，或有時(shí)觀察和鑒定比較困難，從而限制了細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的使用。3、生化標(biāo)記主要指蛋白標(biāo)記，包括貯藏蛋白和酶蛋白，特別是同工酶標(biāo)記。能直接反映基因產(chǎn)物的差異且受環(huán)境影響小。但同工酶表達(dá)有組織和發(fā)育階段特異性、多態(tài)性低、染色及電泳又需因酶不同而調(diào)整，所以其實(shí)際利用受到一定的限制。

4、DNA標(biāo)記DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA水平的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異，因此，DNA標(biāo)記在數(shù)量上幾乎是無限的。二、分子標(biāo)記的特點(diǎn)1、數(shù)量多，幾乎無限。分子標(biāo)記源于基因組的自發(fā)變異，廣泛存在于自然界的各種生物；2、無組織、器官及發(fā)育時(shí)期特異性；3、不受季節(jié)、環(huán)境條件的影響；4、許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能區(qū)分混合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息；5、非等位基因間無上位性作用，互不干擾；6、多數(shù)無表型效應(yīng)，對(duì)目標(biāo)性狀的表達(dá)無影響基于以上優(yōu)點(diǎn)，此技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已用于遺傳圖譜的繪制、基因定位及作物育種實(shí)踐。三、分子標(biāo)記的類型依據(jù)對(duì)DNA多態(tài)性的檢測(cè)手段，DNA標(biāo)記可分為四大類：1、基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記該標(biāo)記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之進(jìn)行雜交，通過放射性自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和應(yīng)用廣泛的RFLP標(biāo)記。2、基于PCR的DNA標(biāo)記根據(jù)所用引物的特點(diǎn)，這類DNA標(biāo)記可分為隨機(jī)引物PCR標(biāo)記和特異引物PCR標(biāo)記。隨機(jī)引物PCR標(biāo)記過去主要有RAPD,近年來發(fā)展了一種新型標(biāo)記：SRAP;

特異引物PCR標(biāo)記一般主要是指SSR標(biāo)記。3、基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記這類DNA標(biāo)記可分為兩種類型，一種是通過對(duì)限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增來顯示限制性片段長度的多態(tài)性，如AFLP；另一種是通過對(duì)PCR擴(kuò)增片段的限制性酶切來揭示被擴(kuò)增區(qū)段的多態(tài)性，如CAPS。4、基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記

一般是由DNA序列中因單個(gè)堿基的變異而引起的遺傳多態(tài)性，如SNP。四、幾種分子標(biāo)記的介紹（一）、RFLP該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會(huì)產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。RFLP包括以下基本步驟：（1）DNA提取；（2）用DNA限制性內(nèi)切酶消化；（3）凝膠電泳分離限制性片段；（4）將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上；（5）用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱Southern雜交）；（6）放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。

RFLP原理圖產(chǎn)生多態(tài)性的原因是內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化。

原位點(diǎn)的消失；新位點(diǎn)的產(chǎn)生。GAATTCCTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III5kb3kb2kb7kbRFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)：（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。1、RAPD標(biāo)記的引物所用引物的核苷酸序列是隨機(jī)的，長度通常為9-10個(gè)堿基，大約只有常規(guī)PCR引物長度的一半，使用短的PCR引物是為了提高揭示DNA多態(tài)性的能力。由于引物較短，所以在PCR中必須使用較低的退火溫度，以保證引物能與模板DNA結(jié)合。設(shè)計(jì)的RAPD引物基本能覆蓋整個(gè)基因組，并且已經(jīng)商品化。（二）、RAPD標(biāo)記2、RAPD的全過程（1）DNA提取；（2）DNA濃度、純度和質(zhì)量的估測(cè)：DNA產(chǎn)率一般為100-200ug/g鮮重組織，根據(jù)A260值可估測(cè)濃度而根據(jù)A260/A280（1.8）比值可估測(cè)純度（1.0A260=50ug/ml1cm光程），DNA電泳也可大致檢測(cè)其純度；（3）PCR擴(kuò)增（20ul體系）：A、94度預(yù)變性3分鐘；B、94度變性30秒，37度復(fù)性30秒，72度延伸2分鐘（40個(gè)循環(huán)）；C、72度延伸7分鐘；D、4度保溫；（4）電泳：1.5%瓊脂糖凝膠電泳，80V電壓1小時(shí)30分；（5）泡膠、成像、拍照RAPD原理圖預(yù)變性(92-95

C,2-5m)變性(92-95

C,30s)復(fù)性(40-60

C,30s)延伸

(72

C,30-60s)總延伸

(72

C,7m)(25-35)經(jīng)過30次的循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。PCR的一般過程PCR全過程雙股DNA要復(fù)制的DNA片段加熱至94~96oC，DNAdenature降溫至50~65oC，primer接上再升溫至72oC，Taqpolymerase接上Taqpolymerase復(fù)制DNA再升溫至94~96oC，DNAdenature再降溫至50~65oC，primer接上再升溫至72oC，Taqpolymerase接上Taqpolymerase復(fù)制DNA復(fù)制出我們要復(fù)制的片段?。?）將RAPD標(biāo)記的特異帶回收；（2）將此DNA片段連接到載體上；（3）對(duì)此DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定；（4）根據(jù)其堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物（18-24個(gè)堿基）；（5）以此特異引物對(duì)基因組DNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，便可擴(kuò)增得到與克隆片段同樣大小的DNA片段。將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記由Zabeau和Vos于1993年發(fā)明。AFLP標(biāo)記是選擇性擴(kuò)增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實(shí)質(zhì)也是顯示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性，只不過這種多態(tài)性是以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測(cè)出來。該技術(shù)結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的簡便高效性，同時(shí)又能克服RFLP帶型少、信息量小以及RAPD技術(shù)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

（三）、AFLP標(biāo)記AFLP技術(shù)原理和操作步驟如下：（1）用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機(jī)限制性片段；（2）接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligonuleotideadapter）；（3）然后根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物，由于限制性片段太多，全部擴(kuò)增則產(chǎn)物難以在膠上分開，為此在引物的3’端加入1-3個(gè)選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對(duì)的片段才能與引物結(jié)合，成為模板被擴(kuò)增，從而達(dá)到對(duì)限制性片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增的目的；（4）最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物分離開來。AFLP原理圖AFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結(jié)果可靠；（5）用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。

由Moore等于1991年創(chuàng)立。SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（多為1-5個(gè)）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性，即SSR標(biāo)記。

（四）SSR1、衛(wèi)星DNA—重復(fù)單元5~200bp，重復(fù)數(shù)可達(dá)105以上，

可形成10~15kb重復(fù)區(qū)。大部分分布于染色體著絲粒區(qū)

和端粒區(qū)。

2、微衛(wèi)星DNA—重復(fù)單元1~4bp，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具較高的多態(tài)性。常用檢查方法：PCR等。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG微衛(wèi)星DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp這是一張人的SSR擴(kuò)增電泳圖該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。微衛(wèi)星DNA差異最小只相差2個(gè)堿基（重復(fù)片段只有2個(gè)堿基）。（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。

SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（五）SNP單個(gè)堿基多態(tài)性，分布于整個(gè)基因組，估計(jì)每500bp有個(gè)。第三代遺傳標(biāo)記。AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCTSNP流程圖常用檢查方法：DNA測(cè)序、芯片雜交等位點(diǎn)1位點(diǎn)2位點(diǎn)3芯片雜交結(jié)果示意圖特點(diǎn)：密集。既可以進(jìn)行連鎖分析，也可以進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。（六）SSCPDNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對(duì)照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。電泳圖對(duì)照實(shí)驗(yàn)（七）SRAP（Li.G&Quiros.C.F,TheorApplGenet,2001,103:455-461）

（1）

設(shè)計(jì)思想：EXONS富含GC且保守

INTRONS富含AT且個(gè)體間差異大

（2）引物設(shè)計(jì)：Forwardprimer10bp+CCGG+3bp

Reverseprimer10bp+AATT+3bp

Exampleofforwardprimers:

me1,5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′,

me2,5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′,

Exampleofreverseprimers:

em1,5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′,

em2,5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′,forwardprimers

5，－3，ME1TGAGTCCAAACCGGATAME2TGAGTCCAAACCGGAGCME3TGAGTCCAAACCGGAATME4TGAGTCCAAACCGGACCME5TGAGTCCAAACCGGAAGME6TGAGTCCTTTCCGGTAAME7TGAGTCCTTTCCGGTCCME8TGAGTCCTTTCCGGTGCME9TGAGTCCAAACCGGTAGME10TGAGTCCAAACCGGCATME11TGAGTCCAAACCGGTCTDC1TAAACAATGGCTACTCAAGPM8CTGGTGAATGCCGCTCTreverseprimers

3，－5，EM1GACTGCGTACGAATTAATEM2GACTGCGTACGAATTTGCEM3GACTGCGTACGAATTGACEM4GACTGCGTACGAATTTGAEM5GACTGCGTACGAATTAACEM6GACTGCGTACGAATTGCAEM7GACTGCGTACGAATTCAAEM8GACTGCGTACGAATTCTGEM9GACTGCGTACGAATTGATEM14GACTGCGTACGAATTCAGEM18GACTGCGTACGAATTCCTOD3CCAAAACCTAAAACCAGGASA4TTCTTCTTCCTGGACACAAAGA18GGCTTGAACGAGTGACTGA

SRAP

primers

SRAP電泳圖分子標(biāo)記的應(yīng)用（一）分子標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建

目前幾乎所有重要農(nóng)作物，如擬南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構(gòu)成，隨著多種標(biāo)記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。水稻第一張分子圖譜是美國cornell大學(xué)于1988年發(fā)表的，當(dāng)時(shí)僅有RFLP標(biāo)記136個(gè)，覆蓋水稻基因組的1389cM，標(biāo)記分布也不甚均勻，有明顯的空白區(qū)域（Gap）；而由日本水稻基因組計(jì)劃1998年發(fā)表的水稻分子圖譜已包括了2275個(gè)標(biāo)記，其中70%為EST，覆蓋了1550cM，平均圖距為1.5cM。遺傳圖譜對(duì)于基因定位至關(guān)重要，圖譜上包括的標(biāo)記數(shù)越多，分布越均勻，則基因定位就越精細(xì)。高密度分子遺傳圖譜的繪制使一些植物的遺傳學(xué)研究取得了重大進(jìn)展，并對(duì)分子標(biāo)記輔助育種選擇技術(shù)和基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。

1、資源收集（1）、國內(nèi)的華南和華北類型（2）、亞洲的日本和韓國類型（3）、以荷蘭為主的歐洲類型（4）、以美國為主的美洲類型美國荷蘭以色列華北型日本種質(zhì)資源2、不同生態(tài)類型黃瓜品種多態(tài)性分析首先利用RAPD對(duì)不同生態(tài)類型的典型品種進(jìn)行分析，挑選多態(tài)性好的引物對(duì)不同材料進(jìn)行多態(tài)性分析，從中選出差異大的品系配置作圖群體。600bpM123456六個(gè)典型的生態(tài)類型RAPD分析（引物T6）M130M3159不同生態(tài)類型黃瓜材料的RAPD分析3、作圖群體的建立

RAPD分析和田間調(diào)查表明，S94與S06、S06與S52間差異較大，因此將S94與S06、S06與S52配置作圖群體。其中S94與S06正在配置重組自交系（RIL)，利用S06與S52的F2代群體構(gòu)建了一張遺傳圖譜。F2群體F2(1----------------------------------------------------------------200)F2F1S06XS52F2(1----------------------------------------------------------------230)F2S94XS06自交7－8代F1F7-8重組自交系（RIL）4、引物篩選0652MSSR10SSR9SSR8SSR7SSR6SSR5SSR4SSR3SSR2SSR1500bp200bpSSR600bpRAPD5、群體分析F2SSRSRAPF20652F2F2F20652RAPD6、圖譜構(gòu)建與基因定位用MapMaker3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得遺傳連鎖圖譜(LOD≥

3)，最大圖距設(shè)置為37.2cMRAPD標(biāo)記連鎖圖

(1109.9cM79markers13.7cM)SRAP標(biāo)記連鎖圖

LG-1LG-2LG-3

LG-4LG-5LG-6LG-7（1164.2cM93markers12.6cM

）lbnlbl連鎖圖

LG-1LG-2LG-3

LG-4LG-5LG-6LG-7190Markers

全長1109.2cM間距5.8cMRAPD:83SRAP:85SSR:19形態(tài)：3側(cè)枝性狀基因定位S06(側(cè)枝強(qiáng))S52(側(cè)枝弱)側(cè)枝基因的定位側(cè)枝性狀LG-2在對(duì)F2分離群體調(diào)查基礎(chǔ)上，將側(cè)枝基因定位在第2連鎖群上，與兩側(cè)標(biāo)記間距分別為6.7cM和5.1cM。始花位和全雌性基因的定位在對(duì)F2分離群體調(diào)查基礎(chǔ)上，將始花位和全雌性基因定位在第3連鎖群上。LG-3全雌性始花位QTL定位1、nlblblplnbnnffnflln注：其中nlb：側(cè)枝數(shù)lbl：側(cè)枝長度plnb：初始側(cè)枝節(jié)位nn：節(jié)數(shù)ffn：始花節(jié)位fl：果長ln：節(jié)距1、nlblblplnbnnffnflln（二）、遺傳多樣性分析