mapmarerexp軟件在遺傳圖譜中的應(yīng)用

mapmarerexp軟件在遺傳圖譜中的應(yīng)用

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展和生物因素組的需要，qtl的定位在國內(nèi)外非常流行。為了準(zhǔn)確定位，需要建立準(zhǔn)確的遺傳譜標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)美國Rockfeller大學(xué)統(tǒng)計遺傳實(shí)驗(yàn)室所提供的信息,目前已開發(fā)的遺傳圖譜構(gòu)建軟件有100多種,而且新的軟件還在不斷涌現(xiàn),但由于Mapmarker/Exp軟件具有操作的自主性和處理數(shù)據(jù)的精確性,并且可以免費(fèi)獲得,自研制成功以來,一直受到國內(nèi)外使用者的青睞。正因?yàn)镸apmarker/Exp軟件的操作具有很大的自主性,整個作圖過程通過命令來完成,導(dǎo)致不同的使用者所建立的遺傳圖譜通常出現(xiàn)較大的差異,特別是對類似小麥含有較大基因組的物種構(gòu)建圖譜時,對某些標(biāo)記到底該歸于哪個連鎖群及標(biāo)記的排列順序還存在很大的爭議,這些爭議除了數(shù)據(jù)本身差異導(dǎo)致外,不同的作圖者使用不同的作圖軟件及設(shè)置不同的參數(shù)值也是一個非常重要的原因。Mapmarker/Exp3.0軟件的許多重要參數(shù)默認(rèn)值并非是最佳值,只是作圖所需的最基本條件,所以有必要對其重新設(shè)置。本文正是通過川麥42×川農(nóng)16重組近交系小麥作圖實(shí)例對Mapmarker/Exp3.0遺傳作圖中的LOD值、maxdistance值等重要參數(shù)進(jìn)行重新設(shè)置并與默認(rèn)值條件下所得結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析,同時對compareandtry、compare和order3種排序方法所給連鎖圖譜進(jìn)行了比較,旨在為最佳作圖參數(shù)和命令的選擇提供參考。1材料和方法1.1共享的近交系群體作圖群體為川麥42與川農(nóng)16雜交,通過單粒傳的方法構(gòu)建的一套包含127個株系的永久性重組近交系群體(F8代),該群體由四川省農(nóng)科院作物研究所提供,具體創(chuàng)建過程見湯永祿。多態(tài)性標(biāo)記包括Xwmc、Xgwm、Cfa、Cfd和Xbarc等232個SSR分子標(biāo)記。1.2基于生物特征的高信息點(diǎn)染色體構(gòu)建利用Mapmarker/Exp3.0軟件對上述作圖群體進(jìn)行遺傳作圖,按照Mapmarker/Exp軟件規(guī)定的格式制表,與親本川麥42條帶相同的記為A,與親本川農(nóng)16條帶相同的記為B,雜合的、模糊不清等記為“-”,按照StephenE.Lincoln推薦的方法,將tripleerrordetection設(shè)為on,用Informativenesscriteria4125定義高信息量標(biāo)準(zhǔn),用suggestsubset650產(chǎn)生高信息量子集,依據(jù)小麥的染色體組,用makechromosome命令定義21條染色體,在高信息量子集中各選2～3個高信息量標(biāo)記分別anchor在21條染色體上,執(zhí)行twopoint命令,結(jié)果為后續(xù)分析所用,在maxdistance為50條件下,LOD值分別為7、6、5、4、3(默認(rèn)值)將其余標(biāo)記分別assign到21條染色體上,凡顯示conflict的標(biāo)記,用attach命令捆綁在LOD值較大的染色體上,小于等于7個標(biāo)記的連鎖群直接用compare命令排序,大于7個標(biāo)記的連鎖群用order命令反復(fù)排序,再用ripple命令對相鄰5個標(biāo)記反復(fù)比較、梳理,對明顯聚集大量標(biāo)記的連鎖群用稍微嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腖OD值再次分組,對unassigned的標(biāo)記用group350分組,用kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距單位(cM),用framework命令構(gòu)建染色體框架并計算圖距,最后用MapDraw繪制連鎖圖譜。1.3u3000高信息分子中ndna的生成用Informativenesscriteria4100定義高信息量標(biāo)準(zhǔn),用suggestsubset430產(chǎn)生高信息量子集,用makechromosome命令定義21條染色體,各選2～3個高信息量標(biāo)記分別anchor在21條染色體上,在LOD值為3的條件下,將maxdistance設(shè)置為60、50(默認(rèn))、30、20、15、10分別assign到21條染色體上。1.4assiag建模用Informativenesscriteria4115定義高信息量,suggestsubset730產(chǎn)生高信息量子集,將剩余標(biāo)記assign330到各染色體上。對7到9個標(biāo)記的連鎖群分別用3種方法排序:①選5個基因型值較大的標(biāo)記,先用compare命令排序,然后用try命令把剩余的標(biāo)記插入(每次插入1～2個標(biāo)記);②直接用compare命令排序;③直接用order命令排序,用ripple命令反復(fù)比較、梳理。2結(jié)果與分析2.1標(biāo)記的密度和標(biāo)記數(shù)選定所有的標(biāo)記,將未anchor在染色體上的標(biāo)記assign到所有染色體上,不同的LOD值,結(jié)果如表1。從表1可以看出:LOD值從7降到3過程中,連鎖標(biāo)記總數(shù)總體呈增加趨勢,由126個增加到166個;長度從999cM增加到1821.8cM;同時,標(biāo)記間的平均距離從7.9cM增加到10.9cM,說明隨著LOD值的降低,新增標(biāo)記長度明顯大于原有標(biāo)記的平均長度。就單個染色體標(biāo)記數(shù)看,隨著LOD值的降低,標(biāo)記數(shù)也呈增加趨勢,但不同的染色體增加的標(biāo)記數(shù)不一,如1A、3A、3B、4B、7B、7D染色體上的標(biāo)記數(shù)基本保持不變,1D、2B、6B、7A染色體上的標(biāo)記數(shù)始終保持一致,說明絕大多數(shù)標(biāo)記都有比較固定的歸屬位置。LOD值從7降到5過程中,單個染色體上的標(biāo)記數(shù)增加平緩或基本保持不變,LOD值從5降到4的過程中,2A染色體上的標(biāo)記數(shù)從5個增加到14個,LOD值從4降到3時,標(biāo)記數(shù)又回落到5,但2D染色體上的標(biāo)記數(shù)又從4個躍增到8個。新增標(biāo)記顯著加大了連鎖群長度,標(biāo)記間的距離也明顯拉大(圖1),并且與世界上比較公認(rèn)的遺傳圖譜也不相符,其中2A染色體下半段新增的是原本在6B染色體上的標(biāo)記,另外,還有一個連鎖群(無法與任一染色體對應(yīng),暫命名為LG0)也出現(xiàn)類似的情況。可見這些新增標(biāo)記無明確的歸屬位置,對LOD值比較敏感。因此在作圖分群時不應(yīng)該強(qiáng)求用同一LOD值,對一些特殊的連鎖群可采用不同的LOD值,如本例中2A染色體不宜采用4,2D染色體不宜采用3,與邢光南等對大豆進(jìn)行作圖分群時遇到的問題類似。2.2up-ssindexgwm-4b染色體標(biāo)記的平均距離采用統(tǒng)一的LOD值,但不同的maxdistance值將全部標(biāo)記assign到各染色體上。結(jié)果表明,當(dāng)maxdistance大于等于30時,單個染色體上的標(biāo)記數(shù)和總連鎖標(biāo)記數(shù)基本保持不變,當(dāng)maxdistance小于30時,隨著maxdistance的減小,單個染色體上的標(biāo)記數(shù)和總連鎖標(biāo)記數(shù)都呈減少趨勢,特別是maxdistance小于20時,標(biāo)記總數(shù)急劇減少,與maxdistance為30或50時的連鎖圖對照,遺漏了大量的正確標(biāo)記。如4B染色體,maxdistance從30降到10時,標(biāo)記數(shù)從9個減少到2個(圖2)。因此,在遺傳作圖時不宜選用過于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膍axdistance值。從圖2可以看出,maxdistance值從15增加到20時,新增標(biāo)記barc1144與標(biāo)記barc1096的距離為17.5,平均距離增加9.07%;maxdistance值增加到30時,新增標(biāo)記xgwm469與標(biāo)記cfd39的距離為23.3,平均距離增加14.4%。由此可見,隨著maxdistance值的增大,新增連鎖標(biāo)記的距離也呈增大趨勢,但增加幅度不大。2.3標(biāo)記的連鎖群t用compareandtry、compare和order命令3種方式排序,結(jié)果見圖3。在7個標(biāo)記的連鎖群中,3種排序式所得連鎖圖的長度(77.1cM)和似然值(-205.67)完全一樣;8個(2B染色體為例)和9個(6B染色體為例)標(biāo)記的連鎖群,只有一個標(biāo)記的順序發(fā)生改變。8個標(biāo)記的連鎖群中,前兩種排序方式所得長度(48.8cM)和似然值(-184.56)完全一樣,用order命令排序所得長度(56.5cM)和似然值(-196.98)較前兩者有所增大,9個標(biāo)記的連鎖群中,3種排序方式所得連鎖群長度(109.4、110.2、110.9cM)和似然值(-265.86、-265.97、-266.11)依次略為增加(圖3)。所以用3種排序方式對9個及9個以下標(biāo)記的連鎖群進(jìn)行排序,結(jié)果并無太大差異,但compare命令采用的是窮盡分析,即對給定連鎖群中每一個標(biāo)記的可能次序計算似然值,當(dāng)標(biāo)記數(shù)高達(dá)8個時,大大增加了計算等待時間(運(yùn)算量為8!/2),給實(shí)際作圖帶來極大的不便,因此筆者推薦小于等于7個標(biāo)記的連鎖群直接用compare命令排序。3構(gòu)建和構(gòu)建高相關(guān)遺傳圖譜目前,Mapmarker/Exp3.0軟件在遺傳圖譜構(gòu)建中已廣泛應(yīng)用,吳為人等探討了利用混合分離分析法和Mapmarker/Exp3.0軟件定位互作基因的策略;張潔夫等用Mapmarker/Exp3.0軟件構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜高密度遺傳圖譜;盧為國等用Mapmarker/Exp3.0軟件構(gòu)建了大豆遺傳圖譜;楊俊品等用Mapmarker/Exp3.0軟件構(gòu)件了玉米分子遺傳框架圖譜;郭得平等用AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了雜種蔥的遺傳圖譜。但Mapmarker/Exp3.0同時也存在一些不足之處,如不能繪制出美觀適用的連鎖圖,部分研究者已開發(fā)了相應(yīng)的輔助軟件,以彌補(bǔ)其在繪圖方面的不足。劉樹兵指出,為提高QTL定位的準(zhǔn)確性,可以從兩個方面考慮,一是從實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行控制;另一種是從圖譜構(gòu)建和統(tǒng)計分析方法進(jìn)行控制,本文正是從圖譜構(gòu)建方法上進(jìn)行了初步探討。3.1種新的標(biāo)記LOD值是任意兩個標(biāo)記連鎖和不連鎖的似然函數(shù)比值的對數(shù),LOD值越大,表示標(biāo)記連鎖的可能性越大。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),如果采用過于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腖OD值分群,容易遺漏大量本來應(yīng)該連鎖的標(biāo)記,如果采用過于寬松的LOD值,極易顯著拉大圖長和標(biāo)記間的距離,降低遺傳圖譜的精確度,甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的錯誤分群。Lincoln推薦先用較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腖OD值分群,如果結(jié)果還可以,再適當(dāng)放松LOD值,但在實(shí)際遺傳作圖中,此法往往導(dǎo)致個別特殊連鎖群的錯誤連鎖,如本例中,LOD值采用3,2D染色體上的標(biāo)記呈錯誤連鎖,而LOD值采用4,2A染色體上的標(biāo)記呈錯誤連鎖。因此在特殊情況下,不同的連鎖群可考慮采用不同的LOD值。3.2up-4.4方法的響應(yīng)面Maxdistance值是連鎖圖譜構(gòu)建時設(shè)置的最大圖距,兩個標(biāo)記間的遺傳距離超出該值視為不連鎖。Mapmarker/Exp3.0軟件的默認(rèn)值為50,能基本滿足作圖要求,但并非是最佳值。本文通過對maxdistance值重新設(shè)定,初步探討了maxdistance值對連鎖圖譜的影響。結(jié)果顯示:如果定義過大的值,一方面,影響圖譜的精確度,另一方面,可能導(dǎo)致錯誤連鎖;如果定義過小的值,容易遺漏大量本該連鎖的標(biāo)記。綜合比較連鎖圖譜標(biāo)記數(shù)量和連鎖距離,認(rèn)為maxdistance值設(shè)定在20到50范圍內(nèi)結(jié)果較好。3.3多次關(guān)聯(lián)的排列順序Lincoln在使用手冊中提到,對于5個和5個以下標(biāo)記的連鎖群,可用compare命令直接排序。對7個標(biāo)記的連鎖群先選5個基因型值較大的標(biāo)記,用compare命令排序,然后用try命令把其余的標(biāo)記插入(每次插入1～2個標(biāo)記)。而邢光南等推