第08章 核酸藥物與基因治療

第08章核酸藥物與基因治療本章的重點(diǎn)內(nèi)容：1.什么是基因工程？2.獲得目的基因的方法有哪些？3.DNA雙脫氧測(cè)序技術(shù)的基本原理。

4.PCR技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用。5.基因定點(diǎn)突變技術(shù)及其應(yīng)用。6.表達(dá)載體的構(gòu)建策略與技術(shù)方法。第一節(jié)基因工程原理簡(jiǎn)介一、基因工程的定義本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設(shè)計(jì)的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行切割和連接，構(gòu)建成正確的重組表達(dá)載體，再應(yīng)用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將該表達(dá)載體導(dǎo)入到細(xì)菌、動(dòng)植物細(xì)胞或受精卵中，使目的基因在宿主體內(nèi)以瞬時(shí)方式或穩(wěn)定方式進(jìn)行表達(dá)，借此研究目的基因的結(jié)構(gòu)與功能，或賦予宿主以新的遺傳性狀，或獲得該基因的表達(dá)產(chǎn)物。這一過(guò)程就是基因工程。

廣義：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；克??；基因打靶；基因組計(jì)劃等均屬于基因工程的范疇。目的基因獲得表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定基因的導(dǎo)入整合與表達(dá)的鑒定二、基因工程的基本步驟表達(dá)產(chǎn)物的提取、純化與鑒定核酸藥物基因工程藥物第二節(jié)基因工程中的方法學(xué)一、基因工程的基本技術(shù)（一）核酸的提取純化

1.RNA提取純化技術(shù)；

2.DNA提取純化技術(shù)；

3.plasmid提取純化技術(shù)。（二）核酸電泳技術(shù)

1.瓊脂糖凝膠電泳

2.SDS（三）感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞總RNA的電泳結(jié)果：核酸電泳技術(shù)

1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS500200010007501002001DL2000marker2BamHI和EcoRI雙切3BamHI單切4HindⅢ單切5重組質(zhì)粒pVAX1/ABPS112345二、一些重要技術(shù)原理介紹

重點(diǎn)：DNA雙脫氧測(cè)序技術(shù)，核酸探針技術(shù)，PCR技術(shù)等。（參見(jiàn)第5章）（一）DNA雙脫氧測(cè)序（二）核酸雜交技術(shù)（三）PCR技術(shù)

（四）目的基因的改造技術(shù)1.引物介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變技術(shù)2.盒式突變(cassettemutagenesis)

3.GenesShuffling三、基因工程中的工具（一）載體

1.質(zhì)粒(plasmid)2.粘粒(cosmid)3.λ噬菌體(λphage)（二）工具酶1.限制性內(nèi)切酶2.外切酶3.連接酶4.聚合酶:klenowI5.核酸酶（三）宿主菌DH5,JM101,JM109;DE3等四、獲得目的基因的方法

基因文庫(kù)（基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)），化學(xué)合成，PCR等方法。還有DD-PCR以及基因芯片等技術(shù)。（一）基因組文庫(kù)目的：種質(zhì)資源的保護(hù)；基因組測(cè)序；基因組基因或調(diào)控序列的克隆等。（二）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建五、表達(dá)載體（重組質(zhì)粒）的構(gòu)建與鑒定1.DNA（載體和目的片段）的酶切與回收。2.目的片段與載體的連接。二者的摩爾比應(yīng)滿足以下比例：粘端：3~5:1；鈍端：6~8:13.轉(zhuǎn)化與重組質(zhì)粒的篩選、鑒定。1）初步鑒定：抗性；α-互補(bǔ)；快速鑒定；原位雜交；PCR。2）酶切鑒定：大小和方向。3）測(cè)序鑒定：雙脫氧測(cè)序法。六、基因?qū)爰夹g(shù)（一）細(xì)菌

1.氯化鈣；2.電穿孔技術(shù)。（二）細(xì)胞1.脂質(zhì)體；2.磷酸鈣；3.電穿孔；4.顯微注射；5.VirusVector。（三）受精卵1.顯微注射；