燒傷對小鼠淋巴細胞細胞增殖能力及il

燒傷對小鼠淋巴細胞細胞增殖能力及il

大面積燒傷后，身體神經(jīng)系統(tǒng)包括各種免疫活動細胞和體液免疫，變化程度不同，對異?；虍惓５拿庖叻磻?yīng)產(chǎn)生了一定的抑制反應(yīng)。具體表現(xiàn)為特異性細胞免疫功能受抑和非特異性炎癥反應(yīng)亢進兩方面,而細胞免疫受抑又以T細胞功能受抑尤為突出,它是嚴重?zé)齻髾C體免疫功能下降和并發(fā)感染及其他并發(fā)癥的重要原因。雖然過去對燒傷后機體T細胞功能改變報道較多,但從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)分析T細胞功能受抑的分子機制尚鮮有報道。基礎(chǔ)研究表明經(jīng)TCRα/β和CD28通路活化是T淋巴細胞活化增殖并執(zhí)行功能的主要信號通路。本研究以18%Ⅲ度燙傷小鼠為模型,以T淋巴細胞TCRα/β和CD28通路為研究對象,對T細胞功能受抑的分子機制進行實驗研究。1材料和方法1.1小鼠正壓熱蒸汽損傷模型昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重23～26g,隨機分為正常對照、傷后2、12、24、96、168h共6組,每組10只。制備燒傷模型:將小鼠背部剪毛,清醒狀態(tài)下高壓熱蒸汽造成18%TBSAⅢ度燙傷(病理切片證實)。傷后腹腔注射等滲鹽水3ml預(yù)防休克,各組動物于相應(yīng)時相腋動脈放血活殺,無菌制備脾淋巴細胞懸液。1.2t細胞的分離參照文獻方法,以尼龍纖維分離細胞懸液中的T細胞,酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色,96%以上為T細胞,臺盼藍染色證明分離出T細胞存活率>95%。1.3指標的識別和方法1.3.1小鼠檢測cd2取調(diào)整濃度至1×106/ml分離純化的T細胞懸液1ml,以1400r/min(普通臺式離心機)離心5min,去上清,以冷磷酸鹽緩沖液(pH7.2)200μl洗滌,去上清,加入Anti-mouseTCRα/βFITC(美國Sigma公司)4μl,陰性對照加入小鼠IgG,置4℃避光孵育30min,離心,棄上清,反復(fù)洗滌2次,以相同緩沖液1ml重懸后檢測。間接法測定CD28:一抗為Purifiedanti-mouseCD28(HamsterIgG),二抗為Anti-hamsterIgG-FITC。以加入熒光抗體測得的陽性率減陰性對照陽性率為測定結(jié)果。1.3.2膜ptk提取物制備取1ml分離純化調(diào)濃度至3×106/ml的T細胞的懸液ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清后壓積細胞立即于4ml胞漿PTK提取液(1mmol/LMgCl2、1mmol/LEDTA、10mmol/LDTT、1mmol/LPMSF、50×10-3g/LAprotinin、10%(體積比)Glycerol、10mmol/LTris-HClpH7.4)混懸。冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3)4℃,7000×g離心去除細胞核及完整細胞。上清37000×g,4℃離心1h,棄上清,沉淀復(fù)懸于4ml膜PTK提取液(20mmol/LMg(AC)2、5mmol/LNaF、0.2mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、0.5%(體積比)NP-40)中,冰上提取1h。再次冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3),4℃、37000×g離心1h,所得上清即為膜PTK提取物(-20℃凍存?zhèn)錅y蛋白含量及酶活性);活性測定參照Kong方法進行。1.3.3含胞漿pkc酶活性測定同樣取新鮮分離純化調(diào)濃度至3×106/ml的T細胞懸液1ml,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清,加入4℃預(yù)冷緩沖液(50mmol/Lβ-2ME,1mmol/LPMSF、1mmol/LEGTA、2.5mmol/LMgCl2、0.34mol/L蔗糖、10mmol/LTris-HClpH7.5)4ml,超聲破碎(300mA,20s×3),37000×g,4℃離心60min,收集上清,上清即含胞漿PKC酶。(-20℃凍存?zhèn)錅y蛋白含量及酶活性);活性測定參照文獻進行。1.3.4濃度試驗2以ConA(5×10-3g/L)為刺激原,Fura-2/AM熒光探針法測定。1.3.5il-2-實驗取5×106/ml純化T細胞懸液0.5ml,加入10g/LConA0.5ml混勻,5%(體積比)CO2、37℃孵箱培養(yǎng)24h,離心收集上清,ELISA法測定IL-2含量(試劑購自深圳晶美公司)。T淋巴細胞增殖活性測定按MTT法進行。1.4統(tǒng)計處理結(jié)果均以ˉx±s表示,采用STAT5.0統(tǒng)計程序處理,包括行方差分析、方差齊性檢驗和t檢驗、相關(guān)分析。2結(jié)果2.1傷后24h評分與正常對照組相比,燒傷后脾臟T淋巴細胞膜TCRα/β呈不同程度降低,以傷后24～96h最明顯;燒傷后T淋巴細胞膜表面共刺激分子CD28陽性表達亦降低,且降低時相明顯早于TCRα/β,即傷后12h已明顯降低,并持續(xù)到傷后96h,見表1。2.24h抑制與正常對照組相比,參與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的PTK活性于傷后2h即出現(xiàn)明顯受抑,傷后12、、24h抑制非常顯著,傷后168h出現(xiàn)回升;胞漿游離鈣Ca2+濃度傷后各時相均降低,其變化趨勢與PTK活性改變較一致,胞漿PKC活性出現(xiàn)先升高(12h,P<0.01),后降低(96～168h,P<0.01)的雙相改變,見表2。2.3il-2變化與正常對照組相比,燒傷小鼠脾臟T細胞增殖能力減弱,明顯減弱出現(xiàn)于傷后12h,傷后24、96h顯著減弱。IL-2分泌傷后明顯降低,傷后24～168h降低有非常顯著性意義(P<0.01)。二者變化趨勢與TCRα/β及CD28陽性率改變較一致。相關(guān)性分析表明:參與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的PTK活性、IL-2分泌及T淋巴細胞增殖能力呈非常顯著正相關(guān)(rPTK/IL-2=0.569,rPTK/IL-2=0.733),見表3。3胞漿優(yōu)化試驗結(jié)果嚴重?zé)齻髾C體特異性細胞免疫功能降低是誘發(fā)感染和其它并發(fā)癥的重要原因。改善傷后機體免疫功能是防治感染和多臟器功能衰竭及提高大面積深度燒傷治愈率的關(guān)鍵。從根本上糾正傷后受損的細胞免疫功能,必須首先弄清導(dǎo)致燒傷后特異性細胞免疫功能下降的分子機制。基礎(chǔ)研究表明,TCRα/β和CD28通路是T細胞活化的主要信號通路。TCRα/β和CD28接收胞外信號后,經(jīng)具有PTK活性的CD3ζ鏈跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞以后,即由肌醇磷脂特異性磷脂酶C水解肌醇磷脂產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DG),升高胞漿游離鈣[Ca2+]濃度和活化PKC,進而激活核因子NF-κB、AP-1、NFAT等,調(diào)節(jié)基因表達,從而影響細胞功能。雖然已有報道,嚴重?zé)齻骉H1/TH2平衡破壞,T細胞反應(yīng)偏向TH2型反應(yīng),引起TH1型細胞因子(IL-2、IFN-γ)產(chǎn)生減少,而TH2型細胞因子(IL-4、IL-10)等分泌增加,但這種傾斜是傷后T細胞總體活性受抑條件下的相對偏移。本實驗以TCRα/β、CD28信號途徑為研究對象,探索嚴重?zé)齻骉細胞功能受抑的分子機制。綜合分析本實驗結(jié)果可以證明:嚴重?zé)齻?參與T細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCRα/β和CD28、PTK活性受抑是制約嚴重?zé)齻骉淋巴細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素。而從TCRα/β、CD28、PTK三者關(guān)系比較分析中可以發(fā)現(xiàn),傷后PTK活性受抑又處于核心地位,其發(fā)生時相甚至早于TCRα/β和CD28。胞漿游離鈣濃度是淋巴細胞活化的最靈敏指標,是各種胞外刺激引起細胞激活的早期變化之一。本實驗研究結(jié)果表明[Ca2+]于傷后12h即出現(xiàn)明顯降低,并持續(xù)整個時相。雖然決定胞漿[Ca2+]濃度有胞外進入量和胞內(nèi)鈣儲釋放兩種因素,但由于PI-PLC活性傷后12h即已降低,故推測,嚴重?zé)齻蟀麧{游離[Ca2+]水平降低主要由于PI-PLC下游產(chǎn)物三磷酸肌醇(IP3)動員胞內(nèi)鈣儲釋放減少所致。國內(nèi)外亦有研究報道,胞內(nèi)游離[Ca2+]濃度降低是傷后T細胞增殖能力減弱和IL-2分泌降低的重要原