第二十一章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

第二十一章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology分子雜交特性（見第二章）探針技術(shù)印跡技術(shù)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)來進行DNA或RNA定性或定量分析的一種技術(shù)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）一種可以將目的微量的DNA片斷擴增100萬倍以上的技術(shù)(末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、電影《侏羅紀(jì)公園》，以及辛普森殺妻案，這四件事情到底有什么相關(guān)？答案是沒有)PCR可以把指定的基因片段

數(shù)量放大百萬倍染色體Mullis(1993)一、基本工作原理以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板3’和5’端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制延模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。重復(fù)這一過程，可使目的DNA片段得以擴增。（一）PCR體系基本組成成分含Mg2+的緩沖液dNTPs耐熱DNA聚合酶TagDNA聚合酶特異性引物一對分別與待擴增DNA序列兩端互補的寡核苷酸片段。模板DNA（二）PCR基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C循環(huán)25~30次使模板DNA完全變性成單鏈。同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除使引物和模板DNA退火結(jié)合此溫度下DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA鏈的延長三個步驟為一個循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進入下一輪循環(huán)第一輪循環(huán)5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B變性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol溫度第二輪循環(huán)5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第三次循環(huán)5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因組DNADNA樣品第一次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)第四次循環(huán)待擴增序列引物A引物B3/5/3/5/5/3/5/3/四、PCR的主要用途PCR的用途基因突變分析基因的體外突變目的基因的克隆DNA序列測定DNA和RNA的微量分析1、與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，直接從組織細胞中的mRNA獲得目的基因；2、利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因片段；3、利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用隨機引物從cDNA文庫中克隆基因。利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的DNA的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對DNA的含量要求很低。理論上只要存在一分子的模板就可以獲得目的片段。RNA需要反轉(zhuǎn)錄。利用PCR結(jié)合其它技術(shù)，可以提高基因突變檢測的敏感性。三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)第三節(jié)核酸序列分析

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