兩親性星型端氨基peg-plga納米膠束的制備及體外細(xì)胞毒性

兩親性星型端氨基peg-plga納米膠束的制備及體外細(xì)胞毒性

近年來(lái)，可生物降解的高大挺拔的聚合物被廣泛用作藥物載體。聚乳液酸聚乙醇酸（plga）具有良好的生物適應(yīng)性和抗生物降解性，已成為常用的藥物載體之一。然而，plga的直接結(jié)構(gòu)允許在用作藥物載體時(shí)引入大量的功能基地，并且很難限制材料的廣泛應(yīng)用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，多臂星聚合物的出現(xiàn)為解決這一問(wèn)題，決定了另一個(gè)方向。這種聚合物的結(jié)構(gòu)通常是規(guī)則的。分子體積可以精確地控制，顆粒的分布可以達(dá)到單分散性，并且可以配置更多的組件。在相同體積的小水流中，星聚合物的分解率可以迅速提高，有利于藥物的負(fù)荷和傳輸。脂溶性可生物降解聚合物用作藥物載體時(shí),在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別吞噬,從而阻止藥物到達(dá)靶向部位,降低了藥物的生物利用度.親水性PEG鏈段的引入可以顯著地提高藥物的生物利用度,PEG具有優(yōu)異的生物相容性,在體內(nèi)能溶于組織液,分子量4000以下的PEG能被機(jī)體迅速排除體外而不產(chǎn)生任何毒副作用,其安全性已經(jīng)得到了美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)的認(rèn)證.將PEG進(jìn)行雙末端改性可以引入官能性基團(tuán)氨基,使用化學(xué)方法將脂溶性材料與雙端氨基PEG反應(yīng)可以得到兩親性聚合物.PEG的引入不僅能夠改善脂溶性材料的親水性,還能賦予材料新的特性和功能:減少生物體內(nèi)蛋白質(zhì)在材料表面的吸附和細(xì)胞的黏附,有效調(diào)控載體的親疏水性和藥物釋放速率,避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別吞噬,從而延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間.同時(shí),由于引入了官能性基團(tuán)氨基,可以使材料更有效地結(jié)合靶向配體或靶分子來(lái)增強(qiáng)藥物的的靶向治療作用.本文設(shè)計(jì)合成了六臂星型PLGA,通過(guò)N-環(huán)己基碳二亞胺(DCC)縮合法引入H2N-PEG-NH2得到新型兩親性聚合物6-s-PLGAx-PEG-NH2,考察了材料的自組裝性能,研究了聚合物納米膠束對(duì)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)的體外細(xì)胞毒性作用.1實(shí)驗(yàn)部分1.1精細(xì)化工所需資源乙交酯,m.p.83.5～85.5℃,北京元生融科技有限公司;DL-丙交酯,m.p.126.5～127.5℃,北京元生融科技有限公司;肌醇,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;聚乙二醇4000(PEG4000),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;丁二酸酐,分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;4-二甲氨基吡啶、N-羥基琥珀酰亞胺和N-環(huán)己基碳二亞胺,純度99%,上海共價(jià)化學(xué)公司;四氫呋喃,色譜純,天津市康科德科技有限公司;二氯甲烷、無(wú)水乙醚和甲醇等溶劑均為市售分析純?cè)噭?Malvernnano-ZS型納米激光粒度儀,英國(guó)Malvern公司;Waters510型凝膠排阻色譜儀(GPC),美國(guó)Waters公司;JEOLJEM1010型透射電子顯微鏡(TEM),日本JEOL電子株式會(huì)社;400MHz核磁共振氫譜儀(1HNMR),美國(guó)Varian公司.Q2000型差示熱量熱分析儀(DSC),美國(guó)TA公司.ZetasizerNano-ZS型動(dòng)態(tài)光散射分析儀(DLS),英國(guó)Malvern公司.1.2由兩親性六臂星組成的氨基peg-plga合成1.2.1聚合物的合成以乙交酯和丙交酯為原料,肌醇為引發(fā)劑,辛酸亞錫為催化劑,在N2氣保護(hù)下,采用開(kāi)環(huán)聚合法在160℃反應(yīng)8h,得到3種引發(fā)劑與單體比例不同的六臂星型PLGA,材料配比參見(jiàn)表1.合成路線參見(jiàn)Scheme1.將產(chǎn)物用二氯甲烷溶解完全,加入無(wú)水甲醇進(jìn)行沉淀,棄去上清液,反復(fù)3次得白色黏稠狀產(chǎn)物,50℃真空干燥至恒重.用1HNMR測(cè)定聚合物的結(jié)構(gòu);用GPC測(cè)定聚合物的分子量分布情況,樣品濃度為2.5～5mg/mL,流動(dòng)相為色譜純的THF,流速為1mL/min,以聚苯乙烯(PS)為標(biāo)準(zhǔn)品,用示差折光檢測(cè)器檢測(cè);用DSC測(cè)定聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg),取5～10mg樣品,在N2氣氛(50mL/min)中,以5.0℃/min的升溫速率從-20℃升溫至60℃.1.2.2以4-二甲氨基吡啶dmap為原料的路線分別稱取3種不同配比的6-s-PLGA各0.1mmol溶于20mL干燥處理過(guò)的1,4-二氧六環(huán)中,同時(shí)各加入丁二酸酐(0.072g,0.72mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.073g,0.6mmol),在N2氣保護(hù)下電磁攪拌過(guò)夜,合成路線見(jiàn)Scheme1.反應(yīng)26h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去多余的溶劑,將濃縮液滴入過(guò)量的冷無(wú)水乙醚中得白色黏稠物,將白色黏稠物溶于30mL二氯甲烷中,分別用體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸(30mL×3)和飽和食鹽水(30mL×3)洗滌.有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥,過(guò)濾,將濾液滴入過(guò)量的冷無(wú)水乙醚中,得白色黏稠狀產(chǎn)物,于40℃真空干燥至恒重,收率為91%.1.2.3聚乙二醇sto-peg-ots的合成稱取PEG4000(20g,5mmol)溶于100mLCH2Cl2中,加入對(duì)甲苯磺酰氯(TsCl)(3.81g,20mmol),攪拌狀態(tài)下加入28mL三乙胺,室溫反應(yīng)12h.反應(yīng)結(jié)束后,用1mol/L鹽酸萃取,向有機(jī)相中加入過(guò)量的無(wú)水碳酸鈉和無(wú)水硫酸鎂,充分?jǐn)嚢?過(guò)濾,濃縮濾液,將濃縮后的濾液滴入過(guò)量的冷無(wú)水乙醚中,得到白色沉淀.40℃真空干燥至恒重,得白色化合物對(duì)甲苯磺?；垡叶?sTO-PEG-OTs).在N2氣保護(hù)下,將對(duì)甲苯磺酰化的PEG溶于40mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF),于40℃電磁攪拌下逐滴加入到乙二胺溶液中反應(yīng)24h.合成路線見(jiàn)Scheme2.反應(yīng)結(jié)束后,將乙二胺減壓蒸餾,得少量濃縮液,將濃縮液滴入冷的無(wú)水乙醚中沉淀,所得產(chǎn)物再用冷無(wú)水乙醚洗滌2～3次,于40℃真空干燥至恒重,即得雙端氨基聚乙二醇,收率為87%.測(cè)定紅外光譜,用元素分析法測(cè)定末端氨基化的轉(zhuǎn)化效率.1.2.4-s-plga200-peg-nh2的合成采用DCC縮合方法合成6-s-PLGAx-PEG-NH2,以6-s-PLGA100-PEG-NH2為例.稱取羧基封端的6-s-PLGA100(0.1mmol)溶于20mL二氯甲烷中,分別加入羧基活化劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.6mmol\,N-環(huán)己基碳二亞胺(DCC)0.6mmol和4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.6mmol.該反應(yīng)在磁力攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下,室溫反應(yīng)24h,反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去沉淀析出的二環(huán)己脲(DCU),再用冷的甲醇和乙醚的混合溶劑進(jìn)行沉淀,并洗滌2～3次,產(chǎn)物于40℃真空干燥至恒重.將上一步的產(chǎn)物溶于20mL二氯甲烷中,在N2氣保護(hù)下逐滴加入到含有過(guò)量的端氨基聚乙二醇(7.2g,1.8mmol)的二氯甲烷溶液中,在磁力攪拌和N2氣保護(hù)下室溫反應(yīng)48h.反應(yīng)結(jié)束后,抽濾除去不溶物,將濾液滴入過(guò)量的冰無(wú)水乙醚中,得到白色黏稠狀產(chǎn)物,再用冰甲醇洗滌2～3次除去過(guò)量的端氨基PEG,產(chǎn)物于室溫真空干燥24h得兩親性6-s-PLGA100-PEG-NH2,收率為67%.合成路線見(jiàn)Scheme3.1.3納米粒子的表征以6-s-PLGA100-NH2為例.稱取100mg6-s-PLGA100-NH2,溶于2mL丙酮溶液中,電磁攪拌下將該溶液逐滴滴入到50mL水中,用透析袋透析除去有機(jī)溶劑,得到納米粒子,冷凍干燥備用.取凍干樣品分別溶于D2O和CDCl3中,用1HNMR驗(yàn)證聚合物的膠束結(jié)構(gòu).取少量納米粒子用水復(fù)溶制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的溶液,超聲溶解后用DLS測(cè)定其粒徑大小及分布情況,并用TEM測(cè)定粒子表面形態(tài)與粒徑大小.1.4mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線用含有100μg/mL鏈霉素、100IU/mL青霉素和10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC).取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀況良好的SMC,用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心沉淀細(xì)胞,用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為3×104Cell/mL,以每孔3×103Cell接種于96孔培養(yǎng)板中(設(shè)4個(gè)復(fù)孔),每孔100μL,在37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)分4組,空白對(duì)照組(不加細(xì)胞)\,陰性對(duì)照組(加細(xì)胞不加樣品)\,陽(yáng)性對(duì)照組(PLGA空白納米粒子,終濃度為665μg/mL,制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn))和實(shí)驗(yàn)組(6-s-PLGA100-PEG-NH2納米粒子,加入100μL各組樣品液使終濃度分別為3.29,13.15,52.65,210.63和842.5μg/mL).待細(xì)胞貼壁后,每孔加入100μL配制好的各組溶液.分別培養(yǎng)24,48,72,96,120h,然后每孔加入20μL用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)新鮮配制的MTT溶液(5mg/mL),繼續(xù)孵育4h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔的OD490,測(cè)定5個(gè)時(shí)間段的OD490,將每組測(cè)定結(jié)果用空白組校正后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.2結(jié)果與討論2.16氨基氫信號(hào)峰的確定圖1譜線a和b分別為6-s-PLGA100-PEG-NH2和6-s-PLGA100的1HNMR譜圖,對(duì)照品為四甲基硅烷(TMS).在6-s-PLGA100鏈段中(譜線a),δ1.569是DLA中CH3氫的信號(hào)峰,δ5.158和4.810分別是DLA的CH氫的信號(hào)峰和GA的CH2氫的信號(hào)峰.對(duì)質(zhì)子峰面積進(jìn)行積分,峰面積比約為3∶2,即DLA中的CH氫與GA中的CH2中氫的數(shù)量比為3∶2,即DLA與GA占聚合物的比例為3∶1.與投料時(shí)丙交酯和乙交酯的比例一致,證明聚合物PLGA的嵌段結(jié)構(gòu)的摩爾比為75∶25.圖1譜線a中未見(jiàn)其它峰的存在,證明聚合物純凈.譜線b中,除了與譜線a相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰外,增加了δ3.636處的吸收峰,為PEG鏈中CH2的信號(hào)峰.證明雙端氨基的PEG已經(jīng)成功地接到多臂PLGA分子鏈的末端.由于氨基在整個(gè)共聚物鏈段中所占的比例很小,所以氨基氫的信號(hào)峰未明顯地表現(xiàn)出來(lái).2.26引發(fā)劑為100和6-s-plga200的分子量表2為3組6-s-PLGAx與6-s-PLGAx-PEG-NH2的GPC測(cè)得的分子量分布數(shù)據(jù).對(duì)于6-s-PLGAx聚合物,其分子量分散指數(shù)均在1.2左右,呈明顯的單分散狀態(tài).6-s-PLGA50,6-s-PLGA100和6-s-PLGA200分子量分別為8700,17000,34000,分子量的比值接近1∶2∶4,與投料時(shí)單體與引發(fā)劑的比值保持一致.這也說(shuō)明引發(fā)劑的量直接影響聚合物的分子量大小,可以通過(guò)控制引發(fā)劑的加入量控制聚合物的分子量.對(duì)于兩親性嵌段共聚物而言,其分子量基本接近于相應(yīng)的聚合物分子量與六條臂上聚乙二醇的分子量之和.這也進(jìn)一步證實(shí)了聚合物的六臂結(jié)構(gòu).另外,測(cè)定分子量時(shí)由于以直鏈聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)樣品,對(duì)于多臂聚合物分子量的測(cè)定會(huì)有一定的誤差.但是目前沒(méi)有測(cè)定支鏈結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)品,因此本研究采用了直鏈聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)樣品作為分子量測(cè)定時(shí)的參考.對(duì)于兩親性嵌段材料,由于PEG鏈段在THF中的伸展性不是很好,測(cè)得的結(jié)果存在的誤差稍大.2.3eg對(duì)6-plgax-peg-nh2和6-s-plgax-peg-nh2的tg分析不同聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)數(shù)據(jù)也列于表2中.由表2可知,對(duì)于6-s-PLGAx,分子量越大,Tg越高,這可能是因?yàn)殡S著分子量的增大,空間位阻也相應(yīng)增大,造成結(jié)構(gòu)上的擁擠或者端基帶有更多的自由體積,使分子有著更大的運(yùn)動(dòng)自由度,即端基效應(yīng)而導(dǎo)致其Tg升高.6-s-PLGAx-PEG-NH2和6-s-PLGAx相比,由于PEG的加入,鏈的柔順性增強(qiáng),而柔順性越好,Tg越低,因此6-s-PLGAx-PEG-NH2的Tg明顯低于6-s-PLGAx.比較3組6-s-PLGAx-PEG-NH2發(fā)現(xiàn),Tg隨著PEG含量的減少而逐漸增大,與共聚物的單臂臂長(zhǎng)關(guān)系不大.2.4苯環(huán)的不對(duì)稱伸圖2為PEG,sTO-PEG-OTs和H2N-PEG-NH2的紅外吸收光譜圖.圖2譜線b中2883,1467和839cm-1分別為C—H的伸縮振動(dòng)、彎曲振動(dòng)和搖擺振動(dòng)的特征吸收峰;在1114cm-1處為C—O—C的不對(duì)稱伸縮振動(dòng);與圖2譜線a相比,在1597cm-1處的吸收為SO2中SO的對(duì)稱伸縮振動(dòng),776cm-1為苯環(huán)的面內(nèi)彎曲振動(dòng);664cm-1處為SO2中S—O單鍵伸縮振動(dòng).可以看出,聚乙二醇的端羥基己經(jīng)與對(duì)甲苯磺酰氯發(fā)生反應(yīng),形成了sTO-PEG-OTs.在圖2譜線c中,3329cm-1處為伯胺—NH2的N—H伸縮振動(dòng)特征峰,1638cm-1處的為NH2的N—H鍵的彎曲振動(dòng),1597和776cm-1處的吸收峰消失,表明化合物sTO-PEG-OTs已經(jīng)成功胺解,生成了H2N-PEG-NH2.用元素分析法測(cè)定了H2N-PEG-NH2的末端氨基含量,計(jì)算出雙末端氨基轉(zhuǎn)化率為91.68%,表明該備方法具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值.2.5膠束形成“殼”的研究在制備空白納米膠束的實(shí)驗(yàn)中,丙酮為兩嵌段共聚物的共溶劑,而水為PEG-NH2嵌段的良溶劑,PLGA嵌段的沉淀劑.在合適的條件下,PLGA嵌段的分子鏈相互纏結(jié)在一起形成膠束的“核”,而溶于水的PEG-NH2嵌段形成膠束的“殼”.對(duì)制得的納米粒子,采用DLS測(cè)得納米粒子的平均直徑為39.98nm,PDI值為0.18,呈現(xiàn)良好的