豬卵母細(xì)胞采集方法的比較研究

豬卵母細(xì)胞采集方法的比較研究

卵母細(xì)胞在體外受刺激和細(xì)胞移植方面發(fā)揮著非常重要的作用。自Mattiolo等用體外成熟的卵母細(xì)胞獲得試管豬以來,卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。卵母細(xì)胞的體外成熟受多種因素影響,不同的采集方法是影響因素之一,可以直接影響到卵母細(xì)胞的采集數(shù)量、采集效率和卵丘細(xì)胞的完整程度。能獲得較多的卵母細(xì)胞數(shù)是研究者所期望的,但同時還要考慮到卵母細(xì)胞采集的效率和卵丘細(xì)胞的完整性,這是因為前者決定著卵母細(xì)胞在體外滯留時間的長短,而后者在成熟培養(yǎng)中決定著對卵細(xì)胞所需營養(yǎng)的輸送,并標(biāo)志著卵母細(xì)胞自身的生長發(fā)育階段。目前采用的卵母細(xì)胞采集方法有抽吸法、解剖法和機械破碎法等。抽吸法雖然操作簡便,容易掌握,采集效率較高,但是采集不完全,對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocytecomplex,COCs)的損傷大,需要大量豬的卵巢;解剖法對卵丘細(xì)胞破壞少,獲得A級COCs多,但是技術(shù)要求高,難掌握,操作費時;機械破碎法獲得的卵母細(xì)胞多,但是獲得卵母細(xì)胞大小差異大,對COCs的損傷很大,適宜于體外培養(yǎng)的細(xì)胞比例不高。COCs的采集效率不僅與從卵巢采集出來的時間有關(guān),還與從卵泡液中挑選出來的時間長短有關(guān)。因此,如何縮短從卵泡液中挑選出COCs的時間也顯得尤為重要。本研究通過對COCs采集效率、COCs完整性及卵母細(xì)胞體外成熟率的比較,研究了解剖法、刀切過濾法和抽吸法3種采集方法對豬卵母細(xì)胞的采集效率和成熟率的影響,以期找出一種對COCs損傷小,采集效率和卵母細(xì)胞成熟率高的卵母細(xì)胞采集方法。1材料和方法1.1巢收集、清洗本試驗用的豬卵巢采自云南省昆明市盤龍區(qū)白龍寺屠宰場。卵巢收集后用保溫瓶2h內(nèi)運回實驗室,然后用37.5℃0.85%的生理鹽水清洗3遍,放入37.5℃0.85%的生理鹽水的塑料瓶(放入37.5℃的水浴鍋)中備用。1.2測試方法1.2.1帶模的卵母細(xì)胞分離將清洗好的卵巢隨機分為3組,分別用抽吸法、解剖法和刀切過濾法3種方法采集COCs。抽吸法:用18號針頭的20mL注射器抽吸卵巢上3～8mm的卵泡,在體視顯微鏡下,用自制玻璃吸管挑選出COCs,記錄COCs個數(shù)、抽吸的采集和挑選的時間,采集時間是指把COCs從卵巢取出所需要的時間,挑選時間是指將COCs從卵泡液及其雜質(zhì)中挑選出來并直至放入成熟培養(yǎng)液中所需要的時間,最后按以下算式計算出采集效率。采集效率(min·個-1)=(采集n個卵巢中的COCs所需要的采集時間+挑選時間)/n(n為卵巢個數(shù))。解剖法:室內(nèi)溫度控制在25～27℃之間。在實驗臺上,將單個卵巢置于直徑為90mm的玻璃皿中。用手術(shù)刀及眼科鑷子將卵巢上直徑約6mm的卵泡逐個切出,盡量去除卵巢的結(jié)締組織。在體視顯微鏡下用前端有極細(xì)彎鉤的眼科鑷子慢慢剝離包在卵泡表面的結(jié)締組織,把卵泡放于TALP液中清洗2次。在體視顯微鏡下觀察卵泡,選擇透明的卵泡,確認(rèn)卵母細(xì)胞所在位置,然后把這個部位放在底部,用2把尖端極細(xì)的眼科鑷子撕破卵泡,對準(zhǔn)卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞調(diào)好焦距,確認(rèn)卵母細(xì)胞的好壞。自動從卵泡內(nèi)浮游出的COCs為不好的COCs,不做使用。沒有自動浮游出來的COCs,用1把鑷子夾住它底部的卵泡內(nèi)膜,另1把鑷子夾住卵泡使之倒翻過來,COCs掉入TALP液,最后用自制的玻璃微吸管挑選出COCs,記錄COCs個數(shù)、解剖的采集和挑選的時間,并按抽吸法計算出采集效率。刀切過濾法:為了縮短從卵泡液中挑選出COCs的時間,我們自行開發(fā)出了一種新的卵母細(xì)胞采集方法——刀切過濾法,即把卵泡的刀切和COCs的過濾2種方法進(jìn)行了有機的結(jié)合。具體方法是:將卵巢浸在盛有TALP液的培養(yǎng)皿中,左手拿鑷子夾住卵巢,右手拿手術(shù)刀隨機劃破2～6mm的卵泡,輕輕地來回擺動卵巢,使卵泡內(nèi)COCs流出。將自制的40、60、80、100和120目的卵母細(xì)胞分離篩(直徑為30mm,高為10mm)從上到下依次重疊,用三腳架固定后放入100mL的燒杯,向40目的卵母細(xì)胞分離篩中輕輕倒入含卵泡液的TALP混合液,然后再用TALP液清洗培養(yǎng)皿2次,清洗液倒入卵母細(xì)胞分離篩。不斷搖擺三腳架使卵母細(xì)胞分離篩上的COCs能充分濾過篩網(wǎng),使COCs根據(jù)直徑大小留在不同的卵母細(xì)胞分離篩上。將含有COCs的卵母細(xì)胞分離篩放入盛有TALP液的35mm培養(yǎng)皿,TALP液的量以卵母細(xì)胞分離篩的篩網(wǎng)剛好浸入TALP液中為宜。用自制的玻璃微吸管挑選出COCs,記錄COCs個數(shù)、刀切和過濾以及挑選的時間,并按抽吸法計算出采集效率。1.2.2中小型株的葉片紅酵母細(xì)胞的制備一般根據(jù)卵母細(xì)胞外圍卵丘細(xì)胞的多少及胞質(zhì)明暗將COCs分為3個等級:含有5層以上的卵丘細(xì)胞,胞質(zhì)均勻較暗的COCs為A級;含有3～5層的卵丘細(xì)胞為B級;含有少許卵丘細(xì)胞或胞質(zhì)不均勻的畸形卵、裸卵和半裸卵為C級。將挑選出的A、B級COCs移入提前做好且已平衡2h的成熟培養(yǎng)液(TCM-199-PVA+EGF,使用時添加0.1mg·mL-1PyruvicAcid、0.1mg·mL-1L-半胱氨酸鹽酸、10%(V/V)豬卵泡液(PFF)、10ng·mL-1EGF)滴中,移入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)38～42h后,用含有0.1%的透明質(zhì)酸酶消化,在體視顯微鏡下挑選出成熟的卵母細(xì)胞。成熟的卵母細(xì)胞的依據(jù)為第一極體排出的細(xì)胞質(zhì)均勻、透明帶與胞質(zhì)間隙明顯的卵母細(xì)胞。計算出各種方法中的卵母細(xì)胞成熟率。1.2.3采集效率的計算及其數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)用SAS統(tǒng)計軟件的Duncan’s檢驗方法進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果2.1花的時間和采集施工方法的比較不同采集方法對卵母細(xì)胞采集效率的影響見表1。每個卵巢采集COCs所需時間,解剖法最多,顯著高于刀切過濾法和抽取法(P<0.05),而刀切過濾法和抽吸法間差異不顯著(P>0.05);每挑選1個COCs所花的時間,解剖法最多,其次是刀切過濾法,最后是抽吸法,三者差異顯著(P<0.05);而每個卵巢采集COCs數(shù),刀切過濾法最高達(dá)12.31個,顯著高于解剖法和抽吸法(P<0.05),解剖法僅為1.55個,顯著低于其他2種方法(P<0.05);采集效率抽吸法最佳,顯著低于解剖法和刀切過濾法(P<0.05),刀切過濾法次之,但顯著低于解剖法(P<0.05)。同一列中標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05),下表同Differentlettersinthesamecolumnshowsignificantdifferenceat0.05level,thesameasbelow2.2刀切過濾法與解剖法不同采集方法對COCs完整性的影響見表2。A級比例,三者間差異顯著(P<0.05),其中解剖法最高,達(dá)87.74%,抽取法最低,僅為15.95%;B級比例,刀切過濾法和抽吸法差異不顯著(P>0.05),但顯著高于解剖法(P<0.05);A、B級比例,解剖法高達(dá)99.23%,顯著高于其他2種方法(P<0.05),刀切過濾法雖然可以達(dá)到58.54%,但與抽吸法差異不顯著(P>0.05);C級比例,解剖法僅為0.4%,但抽取法高達(dá)58.64%,三者間差異顯著(P<0.05)。2.3體外采集結(jié)果比較不同采集方法對卵母細(xì)胞成熟率的影響見表3。卵母細(xì)胞的成熟率,解剖法和刀切過濾法都達(dá)到80%,二者間差異不顯著(P>0.05),但顯著高于抽吸法的42.55%(P<0.05)。2.4100個成熟卵母細(xì)胞所需的卵巢數(shù)量及采集時間100個成熟卵母細(xì)胞所需的卵巢數(shù)量及采集時間見表4。為了更好的比較3種方法的采集效果,我們假設(shè)用每個方法體外培養(yǎng)100個成熟的卵母細(xì)胞,通過卵母細(xì)胞成熟率、A、B級比例、每個卵巢采集COCs個數(shù),換算出3種方法需要的卵巢數(shù)量和總的時間。結(jié)果表明,刀切過濾法需要的卵巢數(shù)量最少,僅為17.4個,而解剖法和抽吸法分別高達(dá)80.6和90.3個;總共需要的時間(采集和挑選的時間)刀切過濾法最低,僅為126.6min,而解剖法最高,為758.9min。3生產(chǎn)方法的影響為了減少發(fā)情對育肥速度、飼料利用效率的影響,提高肉質(zhì)的適口性,中國、日本等亞洲國家習(xí)慣將公、母仔豬劁后育肥。在我國傳統(tǒng)上習(xí)慣在斷奶前對小母豬和小公豬進(jìn)行去勢,使得從屠宰場可以采集卵巢的母豬比例僅為25%左右,即使1個每天屠宰量高達(dá)300頭的屠宰場,全部的卵巢也僅為150個左右,如果扣除當(dāng)中如卵巢囊腫、卵巢萎縮等不能使用的卵巢,則獲得的卵巢數(shù)量會更少。另外,我國與國外不同,很多地方都是凌晨02:00點左右開始屠宰,07:00點左右結(jié)束,卵巢被運回實驗室一般都在08:00點以后,加上采集、挑選卵泡需要的時間,從獲得卵巢到卵母細(xì)胞被放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需時間最長可達(dá)8h以上。卵巢離體時間越短,體外受精后卵裂率越高,而離體時間越長,體外受精效果越差,卵裂率越低。王峰等研究發(fā)現(xiàn),卵巢的保存時間不得超過6h,否則卵裂率和6～8-細(xì)胞發(fā)育率顯著下降。因此,如何快速、高效采集卵母細(xì)胞對于研究人員來說就顯得非常的重要。卵母細(xì)胞的采集方法對獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量和采集的時間影響很大。目前國內(nèi)外對豬、牛和羊卵巢COCs的采集主要用抽吸法,關(guān)于用不同采集方法從卵巢獲取COCs數(shù)量及其卵丘細(xì)胞完整程度和體外成熟率的比較研究很多。目前只有南木甲等和Das等在綿羊和水牛上做過不同采集方法采集效率(min·個-1)的比較研究,對豬的研究少之又少。本研究結(jié)果表明,用抽吸法每個卵巢獲得的COCs數(shù)量為6.29個,顯著低于刀切過濾法的12.31個(P<0.05),這與陳曉宇等的報道相似,而用解剖法從每個卵巢上獲得的COCs數(shù)量僅為1.55個,這是因為在采集時僅挑選直徑約6mm的卵泡,剝離包在卵泡表面的結(jié)締組織難度較大,稍不注意就會弄破卵泡而被迫扔棄,加上最后還要去除自動從卵泡內(nèi)浮游出來的COCs,因此導(dǎo)致每個卵巢獲得的COCs數(shù)量較少。本研究把COCs的采集時間分為每個卵巢采集COCs所需時間和每挑選1個COCs所需時間兩部分。研究結(jié)果表明,抽吸法的采集效率為2.60min·個-1,顯著高于刀切過濾法的7.27min·個-1(P<0.05)。陳曉宇等雖然對不采集方法采集COCs的時間進(jìn)行了比較,但是沒有詳細(xì)說明采集時間是專指從卵巢采集出COCs的時間,還是指從卵巢采集出COCs的時間加上從卵泡液中挑選出COCs的時間,本研究的采集時間抽吸法為1.58min·個-1卵巢,解剖法為5.93min·個-1,兩個研究間的差異可能與采集時間的計算辦法和每個卵巢采集的COCs數(shù)量不同有關(guān)。卵母細(xì)胞的采集方法還影響到卵丘細(xì)胞的完整程度和成熟率。本研究中,解剖法獲得的A級COCs的比例最高,達(dá)到87.74%,B級11.49%,C級僅占0.40%,這可能與卵泡直徑和卵泡內(nèi)COCs能否自動浮游出來的嚴(yán)格挑選分不開。刀切過濾法得到的A、B級的COCs比例高于抽吸法,但差異不顯著(P>0.05),這是因為抽吸法容易傷及卵母細(xì)胞外的卵丘細(xì)胞,出現(xiàn)不完整的COCs。卵丘細(xì)胞的存在和擴散對卵母細(xì)胞的成熟及其以后的發(fā)育是必須的,它可為卵母細(xì)胞的成熟提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究中,解剖法和刀切過濾法的卵母細(xì)胞成熟率高達(dá)80%,顯著高于抽吸法(P<0.05),這可能是因為解剖法和刀切過濾法獲得A級COCs比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于B級比例,相反,抽吸法獲得的A級COCs比例卻低于B級比例,最終導(dǎo)致解剖法和刀切過濾法的卵母細(xì)胞成熟率高于抽吸法。如果在3種方法中把COCs采集效率、COCs完整性及卵母細(xì)胞體外成熟率進(jìn)行單獨比較,我們無法得出哪一種方法較為理想的結(jié)論。因此,我們得假設(shè)用每個方法體外培養(yǎng)100個成熟的卵母細(xì)胞,通過卵母細(xì)胞成熟率、A、B級比例、每個卵巢采集COCs個數(shù),換算出3種方法需要的卵巢數(shù)量和總的時間。本研究中,解剖法雖然獲得A、B級的比例和COCs成熟率最高,但因方法難以掌握,并且只從卵巢中挑選直徑約6mm的卵泡等,導(dǎo)致需要大量的卵巢(80.6個)數(shù)量和最長的時間(758.9min),解剖法雖獲得A、B級COCs比例高達(dá)99.23%,卵母細(xì)胞的成熟率高達(dá)80%,但不僅每個卵巢采集COCs個數(shù)最低,僅為1.55個,而且采集效率也顯著低于刀切過濾法和抽吸法(P<0.05),方法難以掌握;抽吸法雖然單個卵巢的采集效率最高,但因A、B比例和成熟率較低,導(dǎo)致所需卵巢的數(shù)量最多,采集和挑選需要的總時間也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于解剖法。刀切過濾法是通過刀片劃破卵泡而使COCs自然流出,然后通過卵母細(xì)胞分離篩將雜質(zhì)層層過濾使得雜質(zhì)量不斷減少,最后使COCs僅僅過濾到最底部的兩個卵母細(xì)胞分離篩上的一種特殊方法,它對卵丘細(xì)胞的損傷要比抽吸法小得多,有近80%的卵母細(xì)胞成