第11章 色譜分析法概論

1第十一章

色譜分析法概論

Chromatography《分析化學(xué)下冊(cè)》課程進(jìn)樣空氣峰t信號(hào)2

色譜法的概述色譜法的基礎(chǔ)知識(shí)色譜分離的基本理論色譜法的發(fā)展趨勢(shì)主要內(nèi)容31906年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（M.Tswett）從分離植物色素實(shí)驗(yàn)中發(fā)明了色譜分離方法。俄國(guó)植物學(xué)家茨維特11.1概述1906，俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett發(fā)明色譜法，是色譜之父。1931，對(duì)液固吸附色譜的杰出貢獻(xiàn)者庫(kù)恩，分離出60多種胡蘿卜素，核黃素、維生素，獲1938年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。蒂塞利烏斯（Tiselius）因電泳分析方法的研究，發(fā)現(xiàn)血清蛋白組分，獲1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1941，馬?。∕artin）和辛格（Synge）創(chuàng)始分配色譜特別是紙色譜而共獲1952年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。氨基酸自動(dòng)分析儀發(fā)明人S·穆爾（StanfordMoore）和W.H.斯坦（WilliamHowardStein)，定量分析方法解決了有關(guān)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的生物化學(xué)問(wèn)題，獲1972年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。45611.2色譜法的基本知識(shí)色譜過(guò)程：實(shí)現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相，固定相(stationaryphase)和流動(dòng)相(mobilephase)。色譜過(guò)程是組分的分子在流動(dòng)相和固定相間多次“分配”的過(guò)程。組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異與固定相作用差異隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不等差速遷移色譜分離。BAABBABBABABct流動(dòng)相樣品液色譜柱固定相檢測(cè)器7色譜的基本術(shù)語(yǔ)：1.色譜的流出曲線色譜流出曲線：是由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜圖?；€：是在操作條件下，沒(méi)有組分流出時(shí)的流出曲線?；€反映儀器(主要是檢測(cè)器)的噪音隨時(shí)間的變化。峰高

(h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離。峰寬

(W)：色譜峰的寬度取決于組分在柱中遷移擴(kuò)散程度。8標(biāo)準(zhǔn)差(σ)：正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點(diǎn)間距離之半，即0.607倍峰高處的峰寬之半。σ的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。σ越大，組分越分散；反之越集中。峰寬

(W)：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)作切線在基線上所截得的距離。

W=4σ半峰寬

(W1/2)：峰高一半處的峰寬W1/2=2.355σ；W=1.699W1/2三種描述方法：92.保留值保留時(shí)間(tR)：從進(jìn)樣到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的時(shí)間間隔。死時(shí)間

(t0)：分配系數(shù)為零的組分，即不被固定相吸附或溶解的組分的保留時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間

()：某組分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的組分在柱中多停留的時(shí)間。10保留體積(VR)：從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)，所需通過(guò)色譜柱的流動(dòng)相體積。死體積(V0)：由進(jìn)樣器至檢測(cè)器的流路中未被固定相占有的空間。固定相顆粒間間隙、導(dǎo)管的容積、檢測(cè)器內(nèi)腔容積的總和。調(diào)整保留體積（）：由保留體積扣除死體積后的體積。

注意：VR’是定值，tR’與FC成反比113.相對(duì)保留值相對(duì)保留值(r)：兩組分的調(diào)整保留值之比。保留指數(shù)(I)

：用保留時(shí)間緊鄰待測(cè)組分的兩個(gè)正構(gòu)烷烴來(lái)標(biāo)定組分的相對(duì)保留值，又稱Kovats指數(shù)：Ix為待測(cè)組分的保留指數(shù)；z與z+n為正構(gòu)烷烴對(duì)的碳原子數(shù)，n通常為1；規(guī)定正己烷、正庚烷及正辛烷為600、700及800。12例：在ApiezonL柱上，柱溫100℃，用正庚烷及正辛烷為參考物質(zhì)對(duì)，測(cè)得t0=30.0

，正庚烷的tR=204.0

，乙酸正丁酯的tR=340.0

及正辛烷的tR=403.4

。說(shuō)明乙酸正丁酯在ApiezonL柱上的保留行為相當(dāng)于7.756個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴的保留行為。注意：烷烴類組分保留指數(shù)只與被測(cè)物質(zhì)及色譜柱固定相、柱溫有關(guān)，不受固定相用量、載氣種類及流速等條件影響。Ix=100（）=775.6134.相平衡常數(shù)分配系數(shù)（distributioncoefficient；K）：是在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相(s)與流動(dòng)相(m)中的濃度(C)之比。注意：分配系數(shù)僅與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度（和壓力）有關(guān)。是組分的特征常數(shù)。保留因子（capacityfactor；k）：在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量(m)之比，稱為質(zhì)量分配系數(shù)或分配比。與固定相和流動(dòng)相的體積有關(guān)。tR=t0(1+k)tR=t0(1+K

)145.分離參數(shù)分離度(resolution；R)：又稱分辨率。是相鄰兩色譜峰保留時(shí)間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。設(shè)正常峰，W1≈W2=4σ當(dāng)R=1.5時(shí)，99.7%面積（tR±3σ）被分開，?tR=6σ，稱6σ分離。分離因子(

)：又稱為分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)。15色譜法的分類：

1.按流動(dòng)相的分子聚集狀態(tài)分類: GC、LC、SFC等

2.按固定相的分子聚集狀態(tài)分類: GSC、GLC、LSC、LLC等

3.按操作形式分類:

柱色譜法、平面色譜法、毛細(xì)管電泳法等

4.按色譜過(guò)程的分離機(jī)制分類:

分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法、親合色譜法等161.按兩相分子的聚集狀態(tài)分類2.按固定相的固定方式分類柱色譜：填充柱、毛細(xì)管柱色譜平面色譜：紙色譜、薄層色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換能力不同空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同3.按分離的機(jī)制分類液相色譜：液-固色譜、液-液色譜氣相色譜：氣-固色譜、氣-液色譜

色譜分類17色譜基本類型的分離機(jī)理：1.吸附色譜分離原理：利用被分離組分對(duì)固定相表面吸附中心吸附能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。吸附過(guò)程是試樣中組分的分子(X)與流動(dòng)相分子(Y)爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過(guò)程，即為競(jìng)爭(zhēng)吸附過(guò)程。吸附系數(shù)與吸附劑的活性、組分的性質(zhì)和流動(dòng)相的性質(zhì)有關(guān)。圖11-1

吸附色譜示意圖.X.溶質(zhì)分子；Y.流動(dòng)相分子；a.吸附劑；m.流動(dòng)相。18固定相：多為吸附劑，如硅膠、氧化鋁。硅膠表面硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜：一般硅膠高效液相色譜：球型或無(wú)定型全多孔硅膠和堆積硅珠。氣相色譜：高分子多孔微球等流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（硅膠為吸附劑）洗脫能力：主要由其極性決定。強(qiáng)極性流動(dòng)相占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng)，洗脫能力強(qiáng)，使k值小，保留時(shí)間短。Snyder溶劑強(qiáng)度

o：吸附自由能，表示洗脫能力。

o值越大，固定相對(duì)溶劑的吸附能力越強(qiáng)，即洗脫能力越強(qiáng)。19洗脫順序：

ka=KaSa/Vm

在色譜柱（Sa與Vm一定）時(shí)，Ka大的組分保留強(qiáng)，后被洗脫，Ka小的組分在吸附劑上保留弱，先被洗脫。

Ka與組分的性質(zhì)（極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型有關(guān)）。以硅膠為吸附劑：極性強(qiáng)的組分吸附力強(qiáng)。①飽和碳?xì)浠衔餅榉菢O性化合物，不被吸附。②基本母核相同，引入的取代基極性越強(qiáng)，則分子的極性越強(qiáng)，吸附能力越強(qiáng)；極性基團(tuán)越多，分子極性越強(qiáng)(但要考慮其他因素的影響)。③不飽和化合物的吸附力強(qiáng)，雙鍵數(shù)越多，吸附力越強(qiáng)。④分子中取代基的空間排列。20

一些溶劑在硅膠上的

o值溶劑

溶劑強(qiáng)度（

o）溶劑

溶劑強(qiáng)度（

o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40異丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70212.分配色譜法分離原理:利用被分離組分在固定相或流動(dòng)相中的溶解度差別而實(shí)現(xiàn)分離。溶質(zhì)分子在固定相中溶解度越大，或在流動(dòng)相中溶解度越小，則K越大。在LLC中K主要與流動(dòng)相的性質(zhì)（種類與極性）有關(guān)；在GLC中K與固定相極性和柱溫有關(guān)。

圖11-2分配色譜示意圖。Xm流動(dòng)相中游離的組分分子X(jué)s固定相中溶解的組分分子22固定相:

又稱固定液（涂漬在惰性載體顆粒上的一薄層液體）；化學(xué)鍵合相（通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將各種有機(jī)基團(tuán)鍵合到載體上形成的固定相）。流動(dòng)相:

氣液分配色譜法：氣體，常為氫氣或氮?dú)?。液液分配色譜法：與固定相不相溶的液體。

正相液液分配色譜：流動(dòng)相的極性弱于固定相的極性。反相液液分配色譜：流動(dòng)相的極性強(qiáng)于固定相的極性。洗脫順序:由組分在固定相或流動(dòng)相中溶解度的相對(duì)大小而決定。正相液液分配色譜：極性弱的組分后被洗脫。(庫(kù)侖力和氫鍵力）反相液液分配色譜：極性強(qiáng)的組分先出柱。233、離子交換色譜法分離原理：利用被分離組分離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。分為陽(yáng)離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。

固定相和流動(dòng)相：固定相：離子交換劑（離子交換樹脂、化學(xué)鍵合離子交換劑）。

流動(dòng)相：一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖溶液。影響保留行為的因素：受被分離離子、離子交換劑、流動(dòng)相的性質(zhì)影響。m21R圖11-3離子交換色譜示意圖1.固定離子；2.可交換離子R.樹脂骨架；m.流動(dòng)相244、分子排阻色譜法（MEC）分離原理：根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸進(jìn)行分離。也稱為凝膠色譜法。根據(jù)空間排阻（stericexclusion）理論，孔內(nèi)外同等大小的溶質(zhì)分子處于擴(kuò)散平衡狀態(tài)：滲透系數(shù)：Kp=

Xs

/

Xm

（0＜Kp＜1

）由溶質(zhì)分子的線團(tuán)尺寸和凝膠孔隙的大小所決定。在一定分子線團(tuán)尺寸范圍內(nèi)，Kp與分子量相關(guān)，即組分按分子量的大小分離。分子排阻色譜示意圖Ge.凝膠；m.流動(dòng)相Gem大分子流動(dòng)相凝膠孔隙25固定相：多孔凝膠：軟質(zhì)、半軟質(zhì)和硬質(zhì)。主要性能參數(shù)：

平均孔徑：

排斥極限（Kp=0）：不能滲透進(jìn)入凝膠的任何孔隙最低分子量

分子量范圍：排斥極限（Kp=0）與全滲透點(diǎn)（Kp=1）之間的分子量范圍。選擇凝膠時(shí)應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。流動(dòng)相:

要求：能溶解試樣、潤(rùn)濕凝膠，粘度要低。水溶性試樣選擇水溶液為流動(dòng)相（稱為凝膠過(guò)濾色譜gelfiltrationchromatography；GFC）；非水溶性試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑為流動(dòng)相（凝膠滲透色譜gelpermeationchromatography；GPC）。26小結(jié)色譜過(guò)程方程式：分配系數(shù)大的組分保留時(shí)間長(zhǎng)（保留體積大），晚流出色譜柱。K在分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜中，分別為狹義分配系數(shù)K、吸附系數(shù)Ka、選擇性系數(shù)KA/B和滲透系數(shù)Kp，Vs分別為色譜柱（或薄層板）內(nèi)固定液體積、吸附劑表面積、離子交換劑總交換容量和凝膠孔內(nèi)總?cè)莘e。2711.3色譜法基本理論

色譜理論包括兩方面:熱力學(xué)理論：研究分配(分離)過(guò)程，塔板理論（platetheory）。動(dòng)力學(xué)理論：研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響，速率理論（ratetheory）。要使R大，必須：

1、?tR大---?k大----熱力學(xué)

2、W小---峰展寬小---動(dòng)力學(xué)1、

影響保留行為的因素推導(dǎo)色譜過(guò)程方程：在實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，固定相和流動(dòng)相的選擇和體積都是確定的，故tR取決于K，也就是取決于組分的性質(zhì)，所以保留時(shí)間是對(duì)組分進(jìn)行色譜定性的指標(biāo)。Vs固定相的體積Vm流動(dòng)相的體積K↑,tR↑,組分后出柱K＝0，組分不保留K→∞，組分完全保留2、

等溫線在一定溫度條件下，組分在固定相和流動(dòng)相的分配達(dá)到平衡時(shí)，在兩相中的濃度之比值K為常數(shù)，由此繪制出的cs與cm的關(guān)系曲線，稱為等溫線。bccscmtRb前延峰a正常峰c拖尾峰aWh/2h0.05hW0.05hAB對(duì)稱因子/拖尾因子完全對(duì)：fs=1.00對(duì)稱峰：fs=0.95~1.05前延峰：fs＜0.95(A＞B)拖尾峰：fs＞1.05(A＜B)303、塔板理論

始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。塔板理論假定：①在色譜柱內(nèi)每一“塔板”H內(nèi)，組分在兩相間瞬間達(dá)到分配平衡。②流動(dòng)相間歇式進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。③分配系數(shù)在各塔板內(nèi)是常數(shù)。④縱向擴(kuò)散可以忽略。31（一）質(zhì)量分配和轉(zhuǎn)移

1、單一組分B（kB=0.5）的分配和轉(zhuǎn)移

①設(shè)色譜柱的塔板數(shù)n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）號(hào)。 ②將單位質(zhì)量的B加到第0號(hào)塔板上。 ③分配平衡后，0號(hào)塔板內(nèi)ms/mm＝0.333/0.667。 ④進(jìn)入一個(gè)塔板體積的流動(dòng)相（一次轉(zhuǎn)移）。32

組分B(kB=0.5)在n=5的色譜柱內(nèi)及出口的分布

Nr01234柱出口

010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.06833

組分A(kA=1)在色譜柱內(nèi)和出口的分布

nr01234柱出口

010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630