第十四章 基因工程和蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介

湖北工業(yè)大學(xué)精品課程

生物化學(xué)第十四章基因工程和蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院食品工程系第十四章基因工程和蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介

主要內(nèi)容第一節(jié)DNA重組與基因工程第二節(jié)蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介第三節(jié)核酸研究技術(shù)簡(jiǎn)介第一節(jié)DNA重組和基因工程

基因工程亦稱(chēng)遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)的方法，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。蜃詈蟮玫奖磉_(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。一、DNA重組的技術(shù)路線二、基因工程的應(yīng)用與前景三、DNA體外重組常用的酶DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscontainingarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制備

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增

5、克隆基因的鑒定Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)植物冠癭瘤pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

以

噬菌體為載體進(jìn)行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的

噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA的裝配過(guò)程

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

DNA重組體的篩選

載體特征的直接篩選

菌落的原位雜交

免疫學(xué)方法pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活原位雜交法篩選DNA重組體圖解復(fù)印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographyDNA重組技術(shù)的應(yīng)用

(1)開(kāi)辟生物學(xué)研究的新紀(jì)元

反向生物學(xué)（invesebiology）的誕生（2）促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起

基因藥物基因診斷和治療

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物胰島素原的人工合成

胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接感染E.coli胰島素原Ti質(zhì)粒為載體的植物基因工程

I二元載體系統(tǒng)II共整合載體IIIT-DNA的轉(zhuǎn)移與整合Ti輔助質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒pBR型質(zhì)粒（給體質(zhì)粒）宿主特異性外源基因宿主特異性整合帶有外源基因的Ti質(zhì)粒植物DNATi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并插入植物DNA第二節(jié)蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)技術(shù)和核酸技術(shù)的相互增強(qiáng)

在廣泛利用自然界存在的各種蛋白質(zhì)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。這些蛋白質(zhì)只是適應(yīng)生物自身的需要，而對(duì)于它們的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)往往并不合意，需要加以改造。1983年美國(guó)基因公司的Ulmer首先提出蛋白質(zhì)工程這個(gè)名詞，它是指按照特定的需要，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和改造的工程。自此之后，蛋白質(zhì)工程迅速發(fā)展，生物工程的重要組成部分。蛋白質(zhì)工程首先是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過(guò)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和溶液構(gòu)象的研究，積累成千上萬(wàn)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資料，然后按照蛋白質(zhì)形成的規(guī)律，經(jīng)周密的分子設(shè)計(jì)，改造蛋白質(zhì)或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)。研究得多，取得成果最顯著的是生物技術(shù)藥（激素、細(xì)胞因子、酶、酶的激活劑、受體和配體、細(xì)胞毒素和殺菌肽以及抗體等）和工業(yè)用酶的蛋白質(zhì)工程。生物酶工程示意圖

酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能新酶分子藍(lán)圖選擇性修飾方案突變酶

新酶克隆酶產(chǎn)品效用發(fā)展酶基因遺傳設(shè)計(jì)遺傳修飾DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)蛋白質(zhì)技術(shù)和核酸技術(shù)的相互增強(qiáng)插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞推導(dǎo)出AA順序制備合成肽制備對(duì)所編碼蛋白專(zhuān)一的抗體基因或cDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)測(cè)定出AA順序合成cDNA探針制備專(zhuān)一的抗體沉淀核糖體分離mRNA用Southern印跡法篩選DNA文庫(kù)基因或cDNA第三節(jié)核酸研究技術(shù)簡(jiǎn)介一、DNA序列測(cè)定二、基因文庫(kù)與cDNA文庫(kù)三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）DNA測(cè)序的基本戰(zhàn)略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測(cè)的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過(guò)PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開(kāi)，放射自顯影后，根據(jù)長(zhǎng)短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測(cè)DNA的堿基序列。

酶法

化學(xué)法

測(cè)序技術(shù)進(jìn)展酶法序列分析的原理

酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger測(cè)序法

(酶法)

讀出模板互補(bǔ)序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測(cè)序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標(biāo)記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′DNA的測(cè)序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動(dòng)方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件DNA的化學(xué)測(cè)序示意圖

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼測(cè)序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測(cè)序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T引物標(biāo)記法測(cè)序(DyePrimer)

一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。4個(gè)反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP