HPLC法測定菊苣中的果聚糖

HPLC法測定菊苣中的果聚糖（撫順師專生化系07生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)班）摘要：菊粉是以菊苣為原料經(jīng)過提取、精制而成的一種天然的碳水化合物，其主要有效成分是各種果聚糖，是天然的功能性食品配料，其所發(fā)揮的巨大保健作用正逐漸得到體現(xiàn)，并在國內(nèi)外得到廣泛的推廣利用。本文研究用高效液相法來測定菊苣原料中的低聚果糖含量，為生產(chǎn)提供可靠、精確的分析方法，并確保產(chǎn)品的質(zhì)量。方法采用BondapakNH2柱為分析柱，乙腈-水（7：3,V/V）做流動(dòng)相，RID為檢測器建立一套檢測系統(tǒng)，檢測靈敏度高，數(shù)值重現(xiàn)性好，在標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照下，得出相對(duì)準(zhǔn)確確的數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞：菊苣果聚糖高效液相色譜1前言菊粉及其主要生產(chǎn)原料的概述菊苣系維吾爾族習(xí)用藥材，為菊科植物毛菊苣CichoriumglandulosumBoiss.etHout及菊苣CichoriumintybusL.的地下部分。菊苣系菊科多年生草本根莖植物，原產(chǎn)于歐洲的荷蘭、比利時(shí)和法國。我國西北、華北和東北地區(qū)也有分布，是在20世紀(jì)80年代中期由原產(chǎn)地傳入我國的。菊苣莖近光滑。莖生葉少或退化，長圓狀披針形。頭狀花序少數(shù)，簇生；苞片2層，外短內(nèi)長，無毛。在歐洲，菊苣常被用作葉類蔬菜、牧草、菊粉和制糖原料及咖啡的替代品。菊苣全身都是寶，地上部分葉片可做蔬菜或飼料，肉質(zhì)根含有菊粉、咖啡酸和奎寧酸所形成的甙—綠原酸和苦味質(zhì)。其肉質(zhì)根可作為菊粉、低聚果糖及高果糖漿的生產(chǎn)原料。本實(shí)驗(yàn)使用的菊苣原材料是以新疆菊苣作父本，以歐洲菊苣作母本，經(jīng)過幾代雜交提純而成，培育出適合在我國北方地區(qū)廣泛種植的菊苣品種。性味：微苦，咸，涼。功能與主治：清肝利膽，健胃消食，利尿消腫。用于濕熱黃疸，胃痛食少，水腫尿少。此外菊芋也是菊粉的令一主要生產(chǎn)原料，它是菊科多年生草本植物，耐貧瘠和干旱，適應(yīng)性強(qiáng)，我國有零星種植。菊粉也稱菊糖，菊粉的主要成分是各種果聚糖。標(biāo)準(zhǔn)菊粉聚合度為2~60，平均聚合度為10~12，長鏈菊粉的平均聚合度為25，可以有效用作模擬脂肪替代品。商品菊粉為白色無定形粉末，吸濕性很強(qiáng)，無味，沒有任何不良風(fēng)味或者后味，標(biāo)準(zhǔn)菊粉常含有少量單糖和雙糖而略帶甜味，約為蔗糖的10%，而長鏈菊粉沒有甜味。它是一種天然的碳水化合物，幾乎不能被胃酸水解和消化，可被大量有益微生物發(fā)酵，從而具有低聚果糖和膳食纖維的特點(diǎn)。菊粉應(yīng)用范圍很廣，可用作食品添加劑、可溶性膳食纖維及低聚果糖的生產(chǎn)原料，可添加到飲料，焙烤食品、調(diào)味品、乳制品、糖果、糕餅、甜點(diǎn)、保健食品等食品領(lǐng)域，并且能夠與其他食品添加劑結(jié)合使用，在乳制品中增強(qiáng)水果風(fēng)味，菊粉還能用作低能量填充劑，賦予食品一定形狀，改善食品口感，能夠掩蓋或去除強(qiáng)力甜味劑的后味。我們公司生產(chǎn)的菊粉溶水性比較好，25°C下，10g溶于90ml水中，全部溶解，但是比利時(shí)的一家公司生產(chǎn)的菊粉在25C時(shí)，幾乎不溶于水，一般而言，PH大于4的時(shí)候，菊粉不容易水解，而PH值小于4的時(shí)候，以及處于適當(dāng)溫度與條件下，菊粉即被水解為果糖，蔗糖，葡萄糖，因此菊粉不適合應(yīng)用于高酸度軟飲料中。菊粉的生理功能[1][2]（1） 增殖雙歧桿菌、調(diào)節(jié)腸道菌群。改善腸道內(nèi)的微生物菌體，是雙歧桿菌的活化因子；（2） 調(diào)節(jié)腸道功能。提高腸內(nèi)有益菌群的數(shù)量，恢復(fù)腸內(nèi)菌群的平衡；菊粉刺激腸道雙歧桿菌增殖，抑制病原菌增長，提高微生物菌群和氣體量，從而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，縮短了糞便在結(jié)腸內(nèi)的停留時(shí)間，減少了水分吸收時(shí)間,有效防止便秘。膳食中提供菊粉將有效增加老年便秘患者的排便頻率。（3） 不會(huì)引起血糖波動(dòng)。產(chǎn)生的熱能低，能降低血脂，改善脂質(zhì)代謝，降低血液中膽固醇和甘油三脂含量；（4） 促進(jìn)礦物元素的吸收。減少肝臟毒素，能在腸中生成抗癌的有機(jī)酸，有顯著的防癌功能；能促進(jìn)微量元素鐵、鈣的吸收和利用，防止骨質(zhì)疏松癥；（5）調(diào)節(jié)對(duì)脂肪代謝。具有防止便秘，增強(qiáng)B類維生素的合成量，（6）抗腫瘤。提高人體的免疫功能；能減輕食物過敏癥以及排斥反應(yīng)。菊粉的應(yīng)用范例[3]

近年來菊粉的開發(fā)利用受到重視，并已成功應(yīng)用在焙烤食品、糖果、乳制品、飲料以及調(diào)味料等食品領(lǐng)域，表1是菊粉在各種食品中推薦用量以及產(chǎn)品特性。表1菊粉在各種食品中的應(yīng)用：食品菊粉劑量%功能特性乳制品2~10替代脂肪，改善質(zhì)構(gòu)與口感，富含纖維與益生素，泡沫穩(wěn)定冷凍甜點(diǎn)2~10替代脂肪，低能量，改善質(zhì)構(gòu)，熔融性狀焙烤食品與面包2~15富含纖維與益生素，保濕早餐谷物食品與擠壓膨化食品2~20低能量，富含纖維與益生素，增加脆性與膨脹性填充物2~30替代脂肪，低能量，改善質(zhì)構(gòu)巧克力5~30替代蔗糖，耐熱，富含纖維填充料肉制品2~10替代脂肪，品質(zhì)改善，富含纖維片劑2~10替代蔗糖，富含纖維與益生素代餐品2~10替代脂肪，低能量，改善質(zhì)構(gòu)與口感富含纖維填充料，與強(qiáng)力甜味劑協(xié)同增效2果聚糖含量的測定（高效液相色譜法）[4]原理同一時(shí)刻進(jìn)入色譜柱的各組分，由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解，吸附，滲透或離子交換等作用的不同，隨流動(dòng)相在色譜柱兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，由于各個(gè)組分在色譜柱中的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，彼此分離開來，按順序流出色譜柱，進(jìn)入信號(hào)檢測器，在記錄儀上或數(shù)據(jù)處理裝置上顯示出各組分的譜峰數(shù)值，根據(jù)保留時(shí)間用外表法或面積歸一法定量，以外標(biāo)法為仲裁法。材料實(shí)驗(yàn)所用的材料菊苣，是以新疆菊苣作父本，以歐洲菊苣作母本，經(jīng)過幾代雜交改良的優(yōu)良品種，有效成分果聚糖含量較高，于7月中旬種植，生長期為160天左右，于11月末采收，根據(jù)產(chǎn)地不同，暫分為四個(gè)樣品I、II、III、W,通過實(shí)驗(yàn)比較出四個(gè)地區(qū)菊苣原料中果聚糖的含量差異。主要試劑果糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量99.99%），蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量99.99%），乙腈：色譜級(jí)乙腈純水：超純水（過0.45“m水系微孔濾膜）2.4主要儀器高效液相色譜儀（Agilent）：配制BondapakNH2柱，等壓單元泵，示差折光檢測器，手動(dòng)進(jìn)樣器。溶劑過濾系統(tǒng)，流動(dòng)相真空脫氣裝置及0.45um有機(jī)及水系過濾膜微量進(jìn)樣器：50ul分析天平：感量0.0001g5ml小燒杯。25ml容量瓶液相色譜分離條件色譜柱：耐低PH型柱溫：28°C；檢測器：示差折光檢測器流動(dòng)相：乙腈-水（70：30,體積比，經(jīng)過真空脫氣裝置脫氣及過0.2um或0.45um微孔膜）。流速：1.0ml／min；進(jìn)樣體積：20ul色譜分析：取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液注入色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免陽光直射。方法2.6.1菊苣中果聚糖的提取取四個(gè)地區(qū)的菊苣各150g，切絲，分三次提取，提取溫度為90°C.第一次加水500ml,提取時(shí)間為30min；第二次加水400ml,提取時(shí)間為20min；第三次加水300ml，提取時(shí)間為20min。分別將四個(gè)地區(qū)的三次提取液，透過120目濾布，各自綜合起來，得到總提取液。用折光儀測出四個(gè)地區(qū)總濾液濾液的固含，用量筒量出各個(gè)濾液的體積。分別為：1濾液體積為720ml,固含4.9%；11濾液體積為850ml,固含4.9%；III濾液體積為800ml，固含4%；W濾液體積為840ml，固含4%。2.6.2菊苣提取液中果聚糖含量檢測樣品溶液的制備根據(jù)固含稱取適量液體樣品，使其濃度在10mg/ml左右，放入25ml容量瓶中，用純凈水定容，超聲30min。精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.05g，定容于25ml容量瓶中，超聲30min。使用微量進(jìn)樣器分別進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)樣的保留時(shí)間定性樣品中各種糖組分的色譜峰，根據(jù)樣品的峰面積，以面積歸一化法計(jì)算各糖分的百分含量。圖1I樣品的色譜圖I—IF：IDIA,示差l斤死悟號(hào)門026000006.D)-1020304050I—IF：IDIA,示差l斤死悟號(hào)門026000006.D)-1020304050BO70minnF：ILI2500020i：ii：ii：i15000100005000■5000圖2II樣品的色譜圖IIF!ID1A,不差忻先倍號(hào)〔1030^000002.［：■)nRUJ2500020000■15000100005000-5000■10-120-130-150-160IIF!ID1A,不差忻先倍號(hào)〔1030^000002.［：■)nRUJ2500020000■15000100005000-5000■10-120-130-150-160-170min圖3III樣品的色譜圖圖4W樣品的色譜圖nRIU2500020000■15000■100005000-5000IIF：IDIA.差忻龍信號(hào)J026000007.D)oooor--oc；-10~i2030-140-150BO-170Ein圖5國外菊粉的色譜圖計(jì)算峰面積歸一化法分離順序依次為：果糖，葡萄糖，二糖，菊糖S+S12單糖占總糖%二 X100S+S+S+S1234S3二糖占總糖%二 X100S+S+S+S1234S4菊糖占總糖%二 X100S+S+S+S1234S果糖峰面積；S葡糖糖峰面積；S:二糖峰面積；S:菊糖峰面積;1： 2： 342.8計(jì)算結(jié)果根據(jù)峰面積歸一化法，計(jì)算出樣品中各組分糖的百分比，然后推算出原料中各組分糖的大致含量。見表二表2原料中各組分糖的含量^樣組分單糖二糖菊糖I1.983.3516.56II2.074.2817.86III2.524.7620.153.155.2321.103結(jié)論與討論此種方法較原始的化學(xué)檢測方法，結(jié)果相對(duì)來說更精確，有利于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。通過對(duì)四個(gè)不同地塊的原料進(jìn)行同等條件的測試，根據(jù)檢測結(jié)果可以看出，雖然種子相同，可是由于土質(zhì)條件和氣候不同，生長出的原料