育種技術(shù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一花粉生命力測定目的在經(jīng)過一段時間儲藏的花粉或使用遠(yuǎn)地花粉時,則必須測定,便于雜交成果的分析與研究。通過實(shí)驗(yàn)，要求學(xué)生掌握花粉生命力測定的方法。藥品及用具測微尺、顯微鏡、毛筆、載玻片、蓋玻片、恒溫箱、玻璃鉛筆、蔗糖、蒸餾水、硼酸液、聯(lián)苯胺、苯酚、酒精、碳酸鈉、過氧化氫、瓊脂。方法步驟方法可分三類：間接法、直接法、染色法。直接法原理將花粉直接在清潔的同種植物的柱頭上，并且作好隔離工作，然后觀察其雌花之發(fā)育，如果胚珠能夠正常發(fā)育成種子，則說明花粉具有生命力，否則，就沒有生命力。步驟第一步：將花粉直接授在清潔的同種另一植株花的柱頭上，并作好隔離。隔1--3天采集已授過粉的柱頭，固定于開水或F.A.A液中。第二步：染色劑的配置：配置1%苯胺蘭溶液、配置0.5%苯胺蘭乳酸酚。染色鏡檢花柱固定在開水中，并于水中煮爛，而后放在1%苯胺蘭水溶液或0.5%苯胺蘭乳酚中染色24小時,把花柱撕開,蓋上蓋玻片,用大姆指輕壓。鏡檢,若花粉具有生命力,即可觀察到花粉管伸入柱頭組織,若花粉不具生命力,即無花粉管伸入柱頭組織.間接法原理借人為創(chuàng)造的特定條件使花粉萌發(fā)，鑒定花粉生命力。硼酸液培養(yǎng)法配置10、50PPM的硼酸溶液。用毛筆取少量花粉播入已盛硼酸的清潔小瓶并加蓋，放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。取出小瓶充分搖動均勻，用吸管吸一滴于載玻片凹槽內(nèi)，迅速蓋上蓋玻片固定花粉粒，然后至于顯微鏡下觀察。觀察2-----4個載玻片，每凹面隨機(jī)觀察5個視野計(jì)算發(fā)芽率。染色法過氧化物酶測定法原理這是借助于測定花粉內(nèi)過氧化氫酶活性強(qiáng)弱來確定花粉生命力的方法，在活的花粉內(nèi)過氧化氫酶存在，它可以促進(jìn)過氧化物放氧分解，這些剛被放出來的活性氧容易使還原劑氧化，在本實(shí)驗(yàn)中所用的無色的聯(lián)苯胺和苯酚都是還原劑，但它們被氧化后確表現(xiàn)紅色或玫瑰紅色，如果花粉是活的，那么這個反應(yīng)很快，則花粉都被染成紅色或玫瑰紅色，如果花粉是死的，則這一反應(yīng)遲遲不能進(jìn)行，花粉也就保持原色。步驟配置藥液配置聯(lián)苯胺溶液、碳酸鈉溶液、過氧化氫溶液制片取少量花粉放在懸滴載玻片的凹點(diǎn)內(nèi)，滴入一滴甲液，置片刻后，再滴一滴乙液，三分鐘觀察之。發(fā)芽率在顯微鏡下觀察，凡表現(xiàn)紅色或玫瑰紅色的，都是有生命力的花粉，黃色的為沒有生命力的花粉，計(jì)算方法同前。作業(yè)要求花粉生命力測定結(jié)果記載：花粉名稱花粉采收保存方法顯微鏡倍數(shù)繪出花粉發(fā)芽形態(tài)圖分析花粉發(fā)芽率高或低的原因。實(shí)驗(yàn)二室內(nèi)切枝雜交目的種子小而成熟期短的某些樹種可以從樹上采下枝條在室內(nèi)雜交。其好處是便于調(diào)整花期；操作、管理和觀察記載均較方便。通過本實(shí)驗(yàn)，要求學(xué)生掌握楊樹室內(nèi)切枝雜交的基本方法。用具培養(yǎng)筒、枝剪、紙袋、標(biāo)簽、毛筆、擴(kuò)大鏡、花粉瓶、干燥器等。方法步驟1、選擇雜交親本（1）明確育種任務(wù)如選育速生、材質(zhì)優(yōu)良、抗旱、耐寒及耐鹽堿。（2）制定雜交組合根據(jù)育種任務(wù)，確定參加雜交的樹種及父、母本。（3）選擇親本植株選擇生長健壯無病蟲害的單株作為親本。2、雌雄株、花芽與葉芽的識別楊樹屬樹種都是雌雄異株，因此，在選擇雜交親本時，首先要作植株性別鑒定，同時還要區(qū)別葉芽或花芽。3、枝條的采集與修剪在已選好的母樹上，從樹冠中上部剪取直徑粗1.5----2.0厘米，長70----100厘米左右并帶有花芽的枝條，將采回的枝條，去掉徒長枝和葉芽，雄花枝保留全部花芽，以便收集大量花粉，雌花枝則根據(jù)枝條的粗細(xì)選留發(fā)育最好的花芽3----5個力求保留的花芽均勻地分布在枝條的中上部，其余的全部除去。在每個花枝上掛一標(biāo)牌，注明樹種名稱、采條時間。雌花枝還應(yīng)記出保留的花芽數(shù)。4、水培管理上述修剪好的枝條，在水中將基部剪成斜面，以增大枝條的吸水面積，然后插入裝有清水的培養(yǎng)筒內(nèi)。初期室內(nèi)溫度低，可隔一天換一次水。新?lián)Q水應(yīng)與原來的水溫大致相同，枝條基部常有粘液泌出而影響水分的吸收，應(yīng)在換水時將其洗去。如果枝條下端的切口已經(jīng)變色甚至腐爛，則應(yīng)在換水時，在水中剪去一小段。培養(yǎng)筒的沉淀物，應(yīng)該經(jīng)常洗刷。5、花期調(diào)節(jié)為了在雌花開放時有必備的花粉，應(yīng)注意花期調(diào)節(jié)，以保證父本開花比母本早數(shù)天。如果父本與母本的花期相同，則應(yīng)將花枝提早3-----5天放入溫室。如果雄株花期較晚，則必須更早些培育雄花枝，或者把雌花枝置于陰涼潮濕處，以促使雄花比雌花先開。6、隔離為了達(dá)到雜交的預(yù)期目的，必須防止非父本的花粉落到母本的柱頭上，為此，應(yīng)在開花前進(jìn)行隔離。隔離的方法很多，例如把不同雜交組合的枝條放在不同的房間，或者在雌花序上套袋隔離等。7、花粉采集、儲藏和生命力測定8、授粉當(dāng)雌花已經(jīng)開放，柱頭比較明亮，且有透明汁液時，即可授粉。授粉時用毛筆粘取少量花粉輕輕撒在柱頭上，或用噴粉器噴到柱頭上，授粉時毛筆不能觸及柱頭。授粉量不可過多或過少，過多容易吸干柱頭液，不利于花粉發(fā)芽；過少則不能刺激柱頭，也不利于受精。授粉后用擴(kuò)大鏡觀察，花粉粒密布柱頭上即可，同時注意一個花序的各個部分都要授到花粉。由于同一花序的各個小花盛開的時期不同，授粉工作應(yīng)在連續(xù)進(jìn)行2----3天，以每天上午為宜。授粉后應(yīng)在標(biāo)牌上注明父本樹種、授粉日期、授粉人。9、授粉后的管理不同樹種授粉后,約經(jīng)3----5天柱頭即開始枯萎,子房漸漸膨大,進(jìn)入果實(shí)的發(fā)育期,在正常溫度的條件下,從授粉到果實(shí)成熟,均需30----50天,毛白楊類30天左右,加楊類50天左右,小葉楊40天左右.授粉后要經(jīng)常換水,洗刷枝條及培養(yǎng)筒,保持室內(nèi)通風(fēng),把室溫控制在20----22’c,不宜過高,濕度初期不低于85%,后期10、雜種種子的收獲果實(shí)成熟期蒴果裂開并飛出帶有絨毛的種子。為避免種子飛散，當(dāng)蒴果由綠變黃即應(yīng)套上小紗布或紙袋，待蒴果全部張開后取下袋子從絨毛中剝礎(chǔ)種子，按組合分別貯藏，準(zhǔn)備播種。作業(yè)要求：水培管理時要注意什么？隔離的具體方法有哪些？實(shí)驗(yàn)三染色體組型分析目的初步掌握植物染色體組型分析的基本方法。原理組型分析是對染色體組中的每個染色體進(jìn)行測量、計(jì)算以及形態(tài)特征的描述。進(jìn)行植物染色體組型分析，對于研究其起源、進(jìn)化、種間的親緣關(guān)系和種間雜種鑒定等都是重要的手段，是研究細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分類學(xué)的基本方法之一。用具及藥品測微尺、顯微鏡、解剖針、載玻片、蓋玻片、搪瓷盤、培養(yǎng)皿、染色皿、平底指管、三角瓶、恒溫水浴、溫度計(jì)、量筒、酒精燈、支架、石棉網(wǎng)、小滴瓶、吸水紙、橡皮頭鉛筆、染色液、對二氯苯、秋水仙堿、8----羥基喹啉、FAA液、鹽酸。實(shí)驗(yàn)步驟用教師事先準(zhǔn)備好的顯微鏡放大照片直接作組型分析。練習(xí)染色體標(biāo)本的制備并進(jìn)行組型分析。其步驟是：制備染色體標(biāo)本（1）取材選較粗短的根，切取長約0.5厘米的根尖。取材的時間應(yīng)事先經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，選分裂旺盛的材料，則有較好的分裂象。（2）預(yù)處理預(yù)處理的目的是抑制或破壞紡錘絲的形成。促使染色體縮短和分散。便于觀察和計(jì)數(shù)。其方法有秋水仙素水溶液、對二氯苯飽和水溶液、8----羥基喹啉水溶液。（3）前低滲切取分裂旺盛部分根尖，放在0.075MKCl低滲液中，在20----25’（4）去壁倒去KCl溶液，加2.5%混合酶液在25----30’（5）后低滲倒去酶液，用蒸餾水慢慢沖洗2----3次，然后在蒸餾水中停留5---10分鐘，進(jìn)行低滲處理。（6）固定將低滲后的材料用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定。（7）制備細(xì)胞懸浮液材料固定液中用鑷子夾碎，制備細(xì)胞懸浮液。（8）去沉淀靜止片刻，使大塊組織沉淀，然后倒取上層細(xì)胞懸浮液。（9）去上清液將上層細(xì)胞懸浮液,靜止20-----30分鐘，已見細(xì)胞沉淀，用吸管吸去上層清夜，留約1毫升細(xì)胞懸浮液制備標(biāo)本。（10）標(biāo)本制備取一片預(yù)先在蒸餾水中冷凍的清潔載片，用滴管滴2---3滴細(xì)胞懸浮液于其上，立即將載片一端抬起，并輕輕吹氣，使細(xì)胞分散，然后在酒精燈上微熱烤干。（11）染色鏡檢干燥的片子用染色液染色，時間為15----20分鐘，待染上色后，蓋上蓋片，用濾紙將載片上留下的染色痕跡擦凈，即可鏡簡。2、組型分析(1)選材選取10個中期染色體分散良好的細(xì)胞,進(jìn)行顯微鏡攝影取清晰底片放大出照片.或在放大機(jī)下精確描繪染色體的放大圖象到繪圖紙上.(2)測量與計(jì)算在顯微鏡下和放大照片上,對染色體依次進(jìn)行測量和描繪.以微米記下絕對長度,同時計(jì)算出每條染色體的相對長度.(3)同源染色體的配對和編號根據(jù)對染色體實(shí)測結(jié)果進(jìn)行同源染色體配對,并按染色體的長短進(jìn)行編號排列.(4)按上述公式分別求出求出每條染色體的相對長度,臂比的數(shù)值,并標(biāo)記出著絲點(diǎn)位置,列出染色體組型分析表。染色體編號實(shí)際長度(um)相對長度(%)臂比著絲點(diǎn)位置長臂(L)短臂(S)臂比r()(5)選擇最好的分裂相照片，將編號配對的染色體剪下，按長短順序貼于白紙上，著絲點(diǎn)應(yīng)對齊在一條直線上，有隨體的染色體排列在最后，并自定比例在坐標(biāo)紙上繪出染色體組型模式圖。作業(yè)要求：按順序排列的染色體圖在報(bào)告中間。簡要說明著絲點(diǎn)位置，隨體及其它有關(guān)形態(tài)問題。實(shí)驗(yàn)四花粉貯藏目的練習(xí)貯藏的基本方法。原理如果進(jìn)行遠(yuǎn)距離雜交或親本花期不遇，則應(yīng)貯藏花粉，在貯藏期內(nèi)以人為創(chuàng)造的低溫、干燥、黑暗等條件，迫使花粉減低代謝強(qiáng)度，以延長其壽命。方法步驟將采來的花粉首先進(jìn)行干燥，一般以花粉由相互粘結(jié)到極易分散為度。然后將其分裝在指形管或小試管中，花粉不要太多，一般以五分之一管或更少為宜。管口用紗布塞好，管外貼上標(biāo)簽，注明樹種、貯藏日期、貯藏方法及編號。然后放入以不同濃度的硫酸或無水氯化鈣配置的一定濕度的干燥器里。最后把干燥器放在溫度為0-----2’為了了解其生活力的變化可以每隔一定時間取出部分進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)以確定其生命，最后把結(jié)果編制成表格。表一在0’相對濕度%010253550657590硫酸濃度%9563.554.148.443.134.829.417.8附注在相同的溫度條件下,無水氧化鈣所控制的相對濕度改為32%。表二各種貯藏條件下花粉生活力保持情況的統(tǒng)計(jì)表貯藏條件發(fā)芽率%硫酸相對濕度（%）氧化鈣控制相對濕度0255032月日注意事項(xiàng)花粉采集后應(yīng)及時晾干，絕對避免高溫。始終保持用具清潔以免孢子混入，引起發(fā)霉而影響花粉的生命力。每次取用花粉時動作要快，盡量不要使正在貯藏過程中的花粉遭受溫度條件的劇烈變化。實(shí)驗(yàn)五觀察減數(shù)分裂目的觀察細(xì)胞減數(shù)分裂各個時期的特征；了解細(xì)胞中染色體的變化以及和遺傳的關(guān)系；練習(xí)涂抹制片的方法。原理減數(shù)分裂是一種特殊的分裂方式，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，染色體只分裂一次，這樣形成的子代能保證染色體數(shù)目的恒定性。用具及藥品顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、培養(yǎng)皿、酒精燈、量筒、吸水紙、滴管、固定液、醋酸洋紅液、碳酸品紅液。實(shí)驗(yàn)步驟用顯微鏡按次序直接觀察減數(shù)分裂的永久封片。練習(xí)花粉母細(xì)胞涂抹制片方法并進(jìn)行觀察。步驟如下：將采集的史材置于固定液內(nèi)固定2---24小時后，放入70%的酒精液中保存。取已固定好的試材排列在小培養(yǎng)皿中。剝開小孢子葉球或花蕾取出花藥，放在載玻片上。用解剖針輕輕剝開花藥，加一滴醋酸洋紅染色，可在酒精燈上微微加熱。除去藥壁蓋上剝片，再把片子放在吸水紙下，用拇指適力壓下，使材料分開并把周圍的染色液吸干。放在顯微鏡下觀察分裂圖象。上述壓片所得的片子只是臨時觀察，如要長期保存，可按永久性制片的要求進(jìn)行封片。仔細(xì)觀看各個時期的主要特征。作業(yè)：繪出你所看到的分裂圖象，并注明屬于減數(shù)分裂的什么時期。說明減數(shù)分裂的過程，它和有絲分裂有何不同？實(shí)驗(yàn)六針葉樹嫁接技術(shù)目的嫁接是樹木無性繁殖的重要方法，是保存、繁育、推廣良種的有效途徑，通過學(xué)習(xí)，了解和掌握針葉樹常用的嫁接技術(shù)和方法。用具和材料切接刀、芽接刀、劈接刀、鋸子、枝剪、塑料薄膜帶、單面刀片、標(biāo)牌、鋼卷尺、鉛筆等。方法髓心形成層對接法接穗：切取長8----10厘米帶有完整頂芽的側(cè)枝為接穗，除保留頂端6---8束針葉外，其余的針葉全部去掉，用刀片先在接穗基部削一短斜面，然后在背面自頂芽下留有針葉處下斜切至髓心，接著順?biāo)栊目v向平削去半邊接穗，削面要平直光滑，一刀削成，接穗末端成扁契形。砧木：在主干較粗的一年升或二年生部位上，摘除接區(qū)全部針葉，然后兩手持刀片手貼樹干，從上向下通過韌皮部與木質(zhì)部之間切開，露出乳白色的形成層，下端向里斜切一刀，以割斷皮部使成尖齒狀，其切面的長度與接穗削面長度一致。最后將接穗基部楔形部分對準(zhǔn)砧木削面下部的尖齒狀凹面中，逐步往下按壓，將接穗切面貼在砧木削面上，使形成層相互密接，然后用塑料薄膜帶自下而上纏繞，直到上端超過切口以后，再從上而下纏繞，到達(dá)下端后打一個活結(jié)。頂枝劈接法除去砧木嫩枝上部多余的針葉，保留中間的芽，劈開嫩枝頂端，取一年生的嫩枝做接穗，接穗長度5----8厘米，其直徑盡量與砧木相當(dāng)，接穗削成兩個長斜切面，然后把接穗插進(jìn)劈開的嫩枝頂端里，接穗與砧木的樹皮必須對準(zhǔn)，使兩者形成層吻合，最后用塑料帶綁扎。切接法接穗長5------8厘米，下部的針葉全部拔去，切兩刀，一刀削出長3----4厘米的切面，在反面再斜切一刀，削成短切面，使接穗基部成楔形，在砧木嫁接處把皮層連同少量木質(zhì)部削開，并于基部向下斜切一刀，使成楔形，砧木與接穗的切面必須吻合，二者形成層要能接合，最后用塑料薄膜綁扎緊。作業(yè)：檢查各種嫁接方法的成活率，比較各種嫁接方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)七雜種苗的培育和選擇目的掌握雜種種子育苗及雜種植株特征的描述和選擇方法。用具和材料木盆、鑷子、鋼尺、擴(kuò)大鏡、鉛筆、記錄板等，各種雜種種子、農(nóng)藥等。方法步驟一、播種育苗大粒雜種種子，可用一般的方法，在大田內(nèi)播種育苗，小粒種子，由于數(shù)量少，比較珍貴，要求比較細(xì)致，一般采用盆播。播種盆的準(zhǔn)備取沙壤土，加入適量肥料拌勻，經(jīng)過消毒，然后裝入盆中。土層厚15----20厘米，土表細(xì)平，播種前把花盆浸入水中，使水分慢慢從地下放滲入，直至表面完全浸潤為止，最后篩一層消過毒的細(xì)土。播種楊樹種子較小，生命力較短，采收后應(yīng)及時播種，根據(jù)種子質(zhì)量，按2x2厘米左右的距離，均勻地播入盆內(nèi)，播后篩一層消過毒的土，厚度以種子似露非露為宜。幼苗期管理?xiàng)顦浞N子發(fā)芽很快，在陽光充足，溫度適宜的條件下，一晝夜即能長出幼根，2---4天全部發(fā)芽，由于幼根細(xì)嫩，所以早期對水分要求很嚴(yán)格，水分不能太多或太少，澆水方法最好是將花盆浸在水中，使水分上滲，如無條件浸水，可用噴霧器澆水，開始應(yīng)少噴勤噴，每天至少噴一次，后期可減少次數(shù)，每次噴水量增大，噴水后應(yīng)及時松土。幼苗出土后，應(yīng)將花盆放在靠窗處比較明亮的地方，使之在陽光照射茁壯成長，幾天后移出室外，早晚可經(jīng)受陽光照射，逐漸鍛煉其抗干旱的能力，中午則應(yīng)酌情蓋上簾子。楊樹幼苗，容易發(fā)生立枯病，除事先土壤嚴(yán)格消毒外，培養(yǎng)過程中，還應(yīng)經(jīng)常注意觀察，出現(xiàn)病情應(yīng)立即防治。移苗幼苗長到4-----5厘米時，按一定株行距移入圃地，在此期間應(yīng)注意適時灌水，松土，除草，防治病蟲害，追肥等。二、雜種性狀的分析苗木生長結(jié)束后，落葉前，應(yīng)進(jìn)行雜種性狀的分析研究，根據(jù)形狀特征的描述，研究其性狀特點(diǎn)、抗性等，分成不同類型，為進(jìn)一步選擇提供材料。雜交性狀分析盡可能與親本對照比較，用對比的方法進(jìn)行分析描述。不同類型可以選擇典型植株進(jìn)行觀察及描述，內(nèi)容如下：葉葉片的顏色、質(zhì)地、形狀、大小、葉緣、基部和先端、葉脈、腺點(diǎn)、復(fù)被物、葉柄形狀和顏色、葉的著生角度等。莖顏色、園滑或有棱的形狀、皮孔的形狀和大小等。分枝多少、粗度、長短、枝角等。芽形狀、大小、顏色、著生方式、有無復(fù)被物等。其他遭受病蟲害的情況。進(jìn)行雜種形狀分析時，形態(tài)特征的描述應(yīng)盡量準(zhǔn)確，數(shù)量性狀的描述，如葉片大小，可測其絕對值，也可以某一類型為標(biāo)準(zhǔn)，記載其相對大小，還可以按原來的形狀大小繪制草圖，質(zhì)量性狀可進(jìn)行比較描述。雜種苗木的選擇每木調(diào)查在雜種性狀分析之后，即進(jìn)行每木調(diào)查，測每一株的亙際直徑及全高，如該組合內(nèi)有不同類型存在，應(yīng)分別調(diào)查。單株選擇在雜種生長的第一年，根據(jù)每木調(diào)查結(jié)果，從每個組合中選出少量最符合選種目標(biāo)的優(yōu)良單株，剪取地上部分，單株扦插繁殖，而苗根則留在原地繼續(xù)生長，第二年生長末期，根據(jù)這些優(yōu)良單株實(shí)生苗兩年的生長情況，以及材質(zhì)、抗性等鑒定材料初步選出優(yōu)良的原種單株，形成一個無形系，進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，以便進(jìn)入品種比較試驗(yàn)?；旌线x擇為了不致使優(yōu)良的單株漏選，第一年生長期末在單株選擇之后，再從剩余的苗木中選擇基本符合選種目標(biāo)的部分苗木混合扦插繁殖，形成混合無性系進(jìn)入品種比較試驗(yàn)。單株及混合選擇均未入選的苗木，同樣于第一年冬季平茬，第二年仍繼續(xù)觀察其生長情況，如發(fā)現(xiàn)生長比第一年顯著轉(zhuǎn)好的，第二年再列入單株或混合選擇的范圍內(nèi)，繼續(xù)比較觀察和擴(kuò)大繁殖，其余的全部淘汰。作業(yè)要求：對于一個雜交組合的不同類型，分別進(jìn)行分析描述，分析雜種形態(tài)屬于何種遺傳類型。選出一批雜種苗。實(shí)驗(yàn)八多倍體的鑒定目的熟悉和掌握多倍體鑒定的方法。用具及材料顯微鏡、鑷子、解剖針、酒精燈、載玻片、蓋玻片、秋水仙堿液、醋酸洋紅、酒精、醋酸、鹽酸、碘液、花粉、根尖等。方法步驟樹木的組織經(jīng)過秋水仙堿液處理后，是否已經(jīng)變成了多倍體，需要通過