劉欣怡 201100140057 生化實驗報告1

生物化學(xué)實驗報告蛋白質(zhì)濃度的測定（Folin-酚試劑法）劉欣怡2011001400572011級生物基地班周一下午同組者：劉藝2013年3月11號一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)分光光度計的原理和使用方法。2、熟悉并掌握福林（Folin）—酚法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。3、進一步掌握比色法或分光光度法，準(zhǔn)確測定未知樣品。4、學(xué)習(xí)并掌握移液槍的使用方法。5、學(xué)會繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。二、實驗器材（一）材料血清（使用前稀釋200倍）（二）試劑1、標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：200μg/ml。2、Folin-酚試劑甲液：（堿性銅溶液）A液：4%Na2CO3：0.2MNaOH=1:1B液：1%CuSO4：2%酒石酸鈉=1:1臨用時，按甲：乙=50：1混合使用?；旌虾蟮娜芤阂蝗諆?nèi)有效，即現(xiàn)用現(xiàn)配。3、Folin-酚試劑乙液：將100g鎢酸鈉、25g鉬酸鈉、700ml蒸餾水、50ml85%磷酸以及100ml濃鹽酸置于1500ml的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回流10小時。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴，開口煮沸15分鐘，在通風(fēng)櫥內(nèi)驅(qū)除過量的溴。冷卻，稀釋至1000ml，過濾，濾液成微綠色，貯于棕色瓶中。臨用時，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑（由于試劑微綠，影響滴定終點的觀察，可以將試劑稀釋100倍再滴定）。根據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至相當(dāng)于1mol/L的酸（稀釋一倍左右）。貯于冰箱中可以長期保存。本實驗中使用的Folin-酚試劑乙液是原液：水為1:1，而且，老師已經(jīng)配制好了。4、去離子水。（三）器具試管及試管架、移液槍以及塑料槍頭、722型分光光度計、燒杯、標(biāo)簽紙等。三、實驗原理蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物）。藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定蛋白質(zhì)濃度從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率，比重，紫外吸收測定而得知，或化學(xué)方法，如定氮，雙縮脲反應(yīng)。Folin—酚法是一般實驗室中經(jīng)常使用的方法。Folin—酚法是雙縮脲法的發(fā)展，反應(yīng)的第一步涉及堿性溶液中銅一蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個復(fù)合物去還磷鉬酸—磷鎢酸試劑（Folin試劑），產(chǎn)生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。Folin—酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用，濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色反應(yīng)影響，這些物質(zhì)濃度高時必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后色淺。則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1—2倍。進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5μg。通常測定范圍是5～100μg。四、實驗內(nèi)容使用Folin-酚試劑法測定老師所提供的血清中的蛋白質(zhì)濃度。五、實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支洗凈并試管，分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（500微克/毫升）,然后用水補足到1.0毫升，并用標(biāo)簽紙做好標(biāo)記，編號依次為1、2、3、4、5、6，不要混淆試管。接著按順序向各管分別加入5毫升Folin—酚試劑甲液，混勻（使用專門混勻液體的儀器），30℃水浴保溫10分鐘。保溫結(jié)束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚試劑乙液，立即混勻（使用專門混勻液體的儀器），30℃水浴保溫30分鐘。保溫結(jié)束后取出，于640nm處比色。每次測定前，要先潤洗比色管。記錄每個試管中溶液的比色值，然后以光密度（0.D）為縱坐標(biāo)，以酪蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）血清樣品的測定取4支試管，分別加入0.2ml的血清稀釋液（稀釋的目的是使其蛋白質(zhì)含量在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)），再分別加0.8ml的去離子水使使試管中樣品液體積達到10ml。然后分別貼上標(biāo)簽紙，編號為1’、2’、3’、4’。接著按順序向各管分別加入5毫升Folin—酚試劑甲液，混勻（使用專門混勻液體的儀器），30℃水浴保溫10分鐘。保溫結(jié)束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚試劑乙液，立即混勻（使用專門混勻液體的儀器），30℃水浴保溫30分鐘。保溫結(jié)束后取出，于640nm處比色。每次測定前，要先潤洗比色管。記錄每個試管中溶液的比色值?；蛘?，先將四支樣品試管的比色值取平均數(shù)，然后再去標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對的蛋白質(zhì)濃度值。（三）計算依據(jù)記錄的4支試管中的血清樣品的比色值讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)對應(yīng)的酪蛋白溶液濃度，再折算成每毫升血清稀釋液含蛋白質(zhì)的微克數(shù)。然后乘以稀釋倍數(shù)，得出每毫升未稀釋血清蛋白質(zhì)的微克數(shù)，最后計算出每100毫升血清樣品中所含的蛋白質(zhì)的克數(shù)。這樣會有四個結(jié)果，然后取平均值，即為最后結(jié)果數(shù)據(jù)。六、實驗結(jié)果1、實驗數(shù)據(jù)記錄表：管號試劑123456樣品1’2’3’4’標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（200μg/ml）00.20.40.60.81.0////樣品液(ml)//////0.20.20.20.2水(ml)1.00.80.60.40.200.80.80.80.8Folin-酚試劑甲液分別加入5mlFolin-酚試劑甲液，混勻，30℃水浴保溫10minFolin-酚試劑乙液分別加入0.5mlFolin-酚試劑乙液，混勻，30℃水浴保溫30min640nm比色值00.0950.1530.2050.2870.3260.1950.1980.1920.1952、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（注意：因為酪蛋白溶液和樣品溶液都加入5mlFolin-酚試劑甲液和0.5mlFolin-酚試劑乙液然后再去測比色值，所以在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，直接使用標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液加水配成的1ml酪蛋白溶液的濃度即可，這樣方便在全測定完后計算樣品溶液濃度。）3、計算樣品中蛋白濃度：（1）對于四支試管中樣品溶液的比色值，取平均數(shù)：（0.195+0.198+0.192+0.195）/4=0.195（2）對比標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)六支試管測定的數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線即此處的直線，是根據(jù)六個數(shù)據(jù)擬合的直線。有OD值=0.195讀出對應(yīng)的酪蛋白溶液濃度為110μg/ml。（3）樣品溶液中蛋白質(zhì)含量的計算公式：樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量=（X*5*200）/（10^6）=（110*5*200）/（10^6）=0.110g/ml=11.0g/100ml(樣品溶液稀釋了200倍，再加入試管測比色值；10^6μg=1g)七、實驗分析1、我們小組本次實驗順利完成。對于實驗結(jié)果，可以看到4支平行試管中樣品溶液的比色值基本一致，說明平行性好，更是說明實驗成功完成，前面的操作沒有失誤。2、在沒有大失誤的前提下，對于結(jié)果同真實值有差距的誤差進行分析，誤差可能有如下來源：（1）使用移液槍加試劑時，移液槍中殘留一些液體使得加入的變少，或者移液槍的槍頭外側(cè)沾有液體并一起加入試管中使得加入的變多。（2）使用分光光度計測比色值時，比色管潤洗的不重分。（3）分光光度計不很準(zhǔn)確，數(shù)值易跳動。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線是擬合的，實驗中僅六組數(shù)據(jù)，擬合的曲線（此處是直線）和真實的有一定差距。3、在今后使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的實驗中，要注意：學(xué)習(xí)本次實驗，要將待測樣品的濃度降到實驗中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。八、實驗注意事項1、實驗開始前，注意清洗試管，最后用去離子水沖洗試管。2、注意，弄清楚實驗步驟，加試劑的先后順序。3、特別注意：在實驗時，不要將標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液和樣品液加反了。4、注意嚴(yán)格按照實驗步驟所要求的時間進行水浴保溫，不要超時或者時間不足。5、一注意實驗的時間，因為溶液的光密度值是隨著時間在不斷增大的，如果時間超過了30分鐘，則測得的光密度值就不準(zhǔn)確了。6、由于分光光度計比較精密，所以往試管中加藥品的時候要盡量做到準(zhǔn)確。7、在使用分光光度計時，那比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接觸它的光滑面，防止自己手上的油污是測量值不準(zhǔn)確。8、在擦拭比色皿時，要順著一個方向擦。9、在比色皿中裝入的液體量大約要是比色皿體積的三分之二。10注意：酚和檸檬酸對測定有干擾，低濃度尿素，胍，硫酸鈉，硝酸鈉，三氯乙烯，乙醇，乙醚，丙酮對顯色無影響。11、各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。12、注意在用移液槍向試管中加試劑之前，可以先使用去離子水進行練習(xí)。13、使用移液槍時，不要按到底部，否則會不準(zhǔn)。14、計算時注意樣品溶液稀釋了200倍才加入試管中反應(yīng)以及測定比色值。15、計算時注意單位換算。16、注意，每次關(guān)上蓋子測定比色值前，都需要調(diào)節(jié)儀器，即在第一個比色管處透光率100%。17、注意，在第一組測完比色值后，不要取出第一個比色管，一直用第一個比色管來調(diào)儀器。18、實驗結(jié)束后，清洗試管以及比色管，儀器歸位。19、在測比色值時，注意節(jié)約溶液。20、注意測比色值是在640nm條件下。21、分光光度計在使用前要打開預(yù)熱30min，是為了確保測定的準(zhǔn)確性。22、注意使用移液槍加試劑時，槍頭不要混試劑使用，以免污染試劑。九、實驗思考題1、含有什么氨基酸的蛋白質(zhì)能與Folin-酚試劑呈藍色反應(yīng)？答：對于氨基酸，含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能與Folin-酚試劑反應(yīng)呈藍色，因為Folin-酚試劑在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭混合物）。故含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)能和Folin-酚試劑發(fā)生藍色反應(yīng)。2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點。答：（1）優(yōu)點：是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；重復(fù)性好.顏色深,析光度。（2）缺點：是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。3、除血清外哪些樣品可進行蛋白質(zhì)測定?答：尿液，腦脊液，胸腹水等在檢驗時都有蛋白的檢測。不過腦脊液、胸腹水是檢驗其本身的蛋白含量以確定是否正常。尿液可以從一方面反映人體對蛋白質(zhì)的吸收好壞，從而檢測腎臟的健康與否。4、通常蛋白質(zhì)含量測定的方法有哪些？比較優(yōu)缺點。答：定氮法，雙縮尿法（Biuret法），F(xiàn)olin－酚試劑法（Lowry法），紫外吸收法和考馬斯亮藍法（Bradford法）。

凱氏定氮：靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2％；費時，需8～10小時；將蛋白中的氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定，故非蛋白的氮（非蛋白物質(zhì)可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）若不去除也含在測定量中。

雙縮脲法（Biuret法）：靈敏度低，1～20mg，中速20~30分鐘，多肽鍵＋堿性Cu2＋?紫色絡(luò)合物硫酸銨；測定含有某些氨基酸的蛋白質(zhì)；用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。

紫外吸收法：較為靈敏，50～100mg，快速5～10分鐘，蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收。

Folin－酚試劑法（Lowry法）：靈敏度高，～5mg，慢速40～60分鐘，雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原；耗費時間長；操作要嚴(yán)格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。

考馬斯亮藍法(Bradford法)：靈敏度最高，1～5mg，快速5～15分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；

SDS：最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。5、Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量為什么比雙縮脲法靈敏？答：此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚B試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。6、Folin酚法測蛋白質(zhì)含量為什么要求加入乙試劑后立即混勻？答：第一步相當(dāng)于雙縮脲反應(yīng)，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2+作用生成絡(luò)合物；第二步是基于Folin試劑(磷鉬酸和磷鎢酸試劑)在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原生成鉬藍和鎢藍混合物(呈藍色反應(yīng))，因此需要快速混勻,繼續(xù)實驗。十、實驗小結(jié)我們小組順利完成了本次實驗。在實驗中，我們認真聽講，注意試劑的名稱、用法以及用量，仔細認真，不出錯誤。又快又好的完成了本次實驗任務(wù)。本次實驗，我收獲了很多。我學(xué)會了Folin-酚試劑法測量蛋白含量的原理并掌握了它的方法，加強了該法的操作。我還學(xué)習(xí)了分光光度計以及移液槍的使用。本次實驗操作較為簡單，但是要認真仔細，不要加錯試劑或者搞錯試劑加入的順序，而且操作要快而準(zhǔn)確。使用儀器混勻液體時，一定要拿穩(wěn)且按緊，不要灑出去液體。在接下來的實驗中，我要保持認真仔細，和同組者一起加油完成好每一次實驗任務(wù)。十一、參考文獻《生物化學(xué)實驗（第四版）》陳鈞輝、李俊、張冬梅、張?zhí)健⒅焱袢A編；科學(xué)出版社出版。十二、附錄（一）分光光度計的使用722型分光光度計的使用

注意事項：1、測量完畢，速將暗盒蓋打開，關(guān)閉電源開關(guān)，將靈敏度旋鈕調(diào)至最低檔，取出比色皿，將裝有硅膠的干燥劑袋放入暗盒內(nèi)，關(guān)上蓋子，將比色皿中的溶液倒入燒杯中，用蒸餾水洗凈后放回比色皿盒內(nèi)。2、每臺儀器所配套的比色皿不可與其它儀器上的表面皿單個調(diào)換。

使用方法

（1）預(yù)熱儀器將選擇開關(guān)置于“T”，打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘。為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照，預(yù)熱儀器時和不測定時應(yīng)將試樣室蓋打開，使光路切斷。（2）選定波長根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長手輪，調(diào)至所需要的單色波長。（3）固定靈敏度檔在能使空白溶液很好地調(diào)到“100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低的擋，使用時，首先調(diào)到“1”擋，靈敏度不夠時再逐漸升高。但換擋改變靈敏度后，須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度，實驗過程中不要再變動。（4）調(diào)節(jié)T=0%輕輕旋動“0%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，（此時試樣室是打開的）。

（5）調(diào)節(jié)T=100%將盛蒸餾水（或空白溶液，或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤械牡谝桓駜?nèi)，并對準(zhǔn)光路，把試樣室蓋子輕輕蓋上，調(diào)節(jié)透過率“100%”旋鈕，使數(shù)字顯示正好為“100.0”。（6）吸光度的測定將選擇開關(guān)置于“A”，蓋上試樣室蓋子，將空白液置于光路中，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)節(jié)旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”。將盛有待測溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格內(nèi)，蓋上試樣室蓋，輕輕拉動試樣架拉手，使待測溶液進入光路，此時數(shù)字顯示值即為該待測溶液的吸光度值。讀數(shù)后，打開試樣室蓋，切斷光路。重復(fù)上述測定操作1-2次，讀