液體深層培養(yǎng)法培養(yǎng)趨磁細菌amb-1的研究

液體深層培養(yǎng)法培養(yǎng)趨磁細菌amb-1的研究

magnetis模型是一種沿著地磁場的磁力線排列并方向移動的革蘭氏陰性菌的總稱。它可以合成成磁性納米的材料。與合成磁性納米相比，細菌體內合成的納米顆粒具有形狀均勻、粒徑窄、生物膜覆蓋和良好的生物相容性等特點。因此，它對生物、材料和生物化工領域具有許多應用價值[2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12]。目前，關于磁體應用的報道相對較少。液體層壓是磁體細菌最重要的形成方法之一，具有操作簡單的特點。許多中國生物化工實驗室都有潛在的培養(yǎng)條件。當apb-1是一種性質微氧微生物，可以在惡劣環(huán)境下生長，但細胞中的合成磁體只能在氧濃度較低時產生磁體。因此，在本研究中，液體層培養(yǎng)法被用于培養(yǎng)亞硝酸和亞硝酸根，并研究了影響亞硝酸根生長和磁體制造的因素。1材料和方法1.1igma公司的紡粘設備1)試劑.趨磁細菌AMB-1(中科院地質與地球物理研究所潘永信研究員饋贈,美國模式菌種收集中心(ATCC));奎尼酸(分析純,美國Sigma公司);其他試劑均為分析純(廣東汕頭市西隴化工廠或國藥集團化學試劑有限公司).2)儀器.BS210S型電子分析天平(德國Sartorius公司);SPA-250A型恒溫生化培養(yǎng)箱(江蘇南京實驗儀器廠);UV-1600PC型紫外分光光度儀(上海Mapada公司);XSP-3C型生物顯微鏡(上海尚光公司);BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);CKX41型倒置顯微鏡(德國Leica公司).1.2生長狀態(tài)的觀察將趨磁細菌AMB-1從-80℃的冰箱中取出,放入-4℃的冰箱中5～10min.取出后,在室溫下放置2～3min,待菌種解凍后立即轉接.取4個裝有10mL已滅菌的培養(yǎng)基的螺口試管(10mL),分別加入800mL和200mL菌液(各兩管).在26℃恒溫下,靜置培養(yǎng)7～10d,倒置顯微鏡觀察其生長狀況.鏡檢菌液,觀察生長狀況及是否染菌.在計數(shù)板上蓋上蓋玻片,從邊緣滴入菌液,待菌液滲入整個計數(shù)室即可.于40倍光學顯微鏡下觀察計數(shù),取中格、左上格、左下格、右上格、右下格計數(shù).取出在4℃下保存的,裝有10mL已滅菌培養(yǎng)基的螺口試管(10mL),放置至室溫.選取生長較好的兩瓶菌液,用移液槍分別從各瓶中取出200μL和500μL菌液轉入螺口試管中,標記日期,在26℃下恒溫靜置培養(yǎng)2d.1.4細菌生長和生物量從螺口試管中培養(yǎng)至穩(wěn)定期的細菌中選出一瓶進行記數(shù)(計數(shù)板計數(shù)法),并在D(600)處測其吸光度值.從該管中取出10mL菌液作為母液,進行梯度稀釋,并測其吸光度值.實驗結果表明,菌體密度在3×107～17×107cell·mL-1時與D(600)成較好的線性關系,相關系數(shù)R達到0.9990以上.隨著細菌密度的增大,D(600)值也相應增大,表明細菌數(shù)量對應增加,在一定程度上反映了細菌的生長狀況.因此,以下關于細菌的生物量指標均采用D(600)值來反映生物量.1.5培養(yǎng)基的制備按照ATCCmedium:1653RevisedmagneticSpirillumgrowthmedium(MSGM)配制所需培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基分裝于500mL三角燒瓶中,每種條件各4瓶,在121℃下滅菌20min,冷卻后分別加鐵源.鏡檢活化的菌液,取細菌數(shù)量較多,形態(tài)均一,磁敏性較好的菌.取上述各個條件的培養(yǎng)基各一瓶,分別轉入5mL菌液,在26℃下恒溫靜置培養(yǎng)2d,制作種子液.選取每種條件的培養(yǎng)基各3瓶,分別接入5mL相應的種子液,于26℃下恒溫靜置培養(yǎng).將紫外分光光度計波長設置為600nm,用玻璃比色皿以蒸餾水調零,取約3mL待測菌液加入比色皿中,每隔12h測定D(600)值及Cmag值.在分光光度計中,對待測菌液分別外加水平磁場和垂直磁場,于波長600nm測定D(600)值和Cmag值.其中:產磁能力Cmag為水平磁場下和垂直磁場下的D(600)的比值.2結果與討論2.1裝瓶量對amb-1生長進程的影響考察裝瓶量(φ)對AMB-1生長的影響,如圖1所示.由圖1(a)可知:在裝瓶量分別為50%,75%,100%的情況下,AMB-1生長進程相似,沒有明顯差異;生長曲線顯示了細菌生長4個時期(0～12h是延滯期,12～36h為對數(shù)生長期,36～84h為生長穩(wěn)定期,84h之后為衰亡期).因此,裝瓶量對AMB-1的生長進程沒有明顯影響.由圖1(b)可知:當裝瓶量分別為50%,75%,100%的情況下,AMB-1穩(wěn)定期的菌體數(shù)量也逐漸減少,在裝瓶量為50%時相對最高(0.086±0.003);而裝瓶量為100%時相對最低(0.068±0.002).說明隨著裝瓶量的增加,培養(yǎng)瓶中空氣的減少,AMB-1生長會受到抑制,細胞數(shù)量會減少.由圖1(c)可知:當培養(yǎng)基裝瓶量為100%時,AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值達到最高(1.348±0.029);而培養(yǎng)基裝瓶量為50%時AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值達到最低(1.307±0.014);裝瓶量越大,即培養(yǎng)瓶中空氣越少,AMB-1產生的磁小體數(shù)量越多.2.2feso4與qfe3+對amb-1細胞生長的影響考察不同鐵源對AMB-1生長的影響,如圖2所示.由圖2(a)可以看出:不同鐵源在添加量相同的情況下,AMB-1生長進程相似,沒有明顯差異.AMB-1在以FeSO4與QFe3+為鐵源時生長優(yōu)于以FeCl3為鐵源,主要表現(xiàn)為其D(600)值略高,且穩(wěn)定期相對較長.原因可能是FeSO4中的鐵離子為二價鐵,而其余兩種鐵源中的鐵離子為三價鐵,對AMB-1來說,可能二價鐵更易于其細胞吸收利用,其具體機理有待進一步研究.由圖2(b)可知:當加入FeSO4與QFe3+時,AMB-1穩(wěn)定期的菌體數(shù)量相差不大;加入FeCl3時菌體數(shù)量相對較少;加入FeSO4時相對最高(0.091±0.002);加入FeCl3時相對最低(0.078±0.002).因此,FeSO4與QFe3+作為鐵源更適合AMB-1細胞的生長.由圖2(c)可知:在加入FeSO4培養(yǎng)基中AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值達到最高(1.21±0.02);加入FeCl3的培養(yǎng)基中AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值達到最低(1.071±0.013).因此,以FeSO4作為鐵源時,AMB-1產生的磁小體數(shù)量較以QFe3+與FeCl3為鐵源時多.該現(xiàn)象表明:培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵相對于QFe3+與FeCl3更有助于磁小體的合成,也可以推測二價鐵離子有利于細菌細胞吸收,便于在體內合成磁小體.目前關于趨磁細菌是優(yōu)先利用Fe3+,還是Fe2+尚沒有定論.張宇紅通過正交實驗考察了硫酸亞鐵、檸檬酸鐵和奎尼酸鐵對AMB-1生長的影響,結果顯示奎尼酸鐵(Fe3+)是較優(yōu)條件.晏磊等考察了鐵源對氧化亞鐵硫桿菌合成磁小體的影響,結果表明合成磁小體的鐵源為Fe2+,而非Fe3+.2.3amb-1不同濃度feso4菌體的生長情況考察不同F(xiàn)eSO4濃度(c(FeSO4))對AMB-1生長的影響,如圖3所示.由圖3(a)可知:FeSO4濃度在10～160μmol·L-1情況下,AMB-1生長進程相似,沒有明顯差異;濃度為20μmol·L-1時,D(600)略高,且生長穩(wěn)定期持續(xù)時間較長.由圖3(b)可知:FeSO4濃度在20～160μmol·L-1時,AMB-1穩(wěn)定期的菌體數(shù)量相差也不大;濃度為20μmol·L-1時相對最高(0.065±0.002);濃度為40μmol·L-1時相對最低(0.053±0.004).由圖3(c)可知:AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值隨培養(yǎng)基中FeSO4濃度的增加而遞增;在濃度為160μmol·L-1時達到最高(1.392±0.013).因此,培養(yǎng)基中硫酸亞鐵濃度的增加有助于磁小體的合成.在實驗中發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象,培養(yǎng)基FeSO4濃度較高時,靜置培養(yǎng)一段時間后會出現(xiàn)不同程度的紅褐色沉淀,濃度為80μmol·L-1及160μmol·L-1時尤其明顯.因此,多添加的FeSO4不會溶解到培養(yǎng)基中,無法被AMB-1所利用.上述結果并不完全表明培養(yǎng)基中FeSO4濃度對AMB-1生長進程和菌體數(shù)量影響不明顯,要進一步考察培養(yǎng)基中可溶性鐵源對AMB-1生長的影響.2.4培養(yǎng)基碳源的選擇碳源作為能源為AMB-1生長提供碳元素,而AMB-1對不同碳源的利用度不一樣,不同碳源對AMB-1生長的影響如圖4所示.由圖4(a)可知:加入琥珀酸的培養(yǎng)基AMB-1細胞有所生長,但是生長進程中缺少穩(wěn)定期,達到最高點后直接下降;而加入酒石酸、檸檬酸、乙酸鈉時的培養(yǎng)基AMB-1細胞基本未有生長.因此,除琥珀酸外其他碳源不適合以單一碳源的形式作為碳源加入培養(yǎng)基中.由圖4(b)可知:加入琥珀酸的培養(yǎng)基中AMB-1的菌體數(shù)量較多,達到(0.091±0.002);而加入酒石酸、檸檬酸和乙酸鈉的培養(yǎng)基中在AMB-1的菌體數(shù)量極少,基本無生長.因此,以酒石酸、檸檬酸和乙酸鈉作為單一碳源不適合AMB-1的生長.由圖4(c)可知:酒石酸、乙酸鈉和檸檬酸的Cmag值均為1,即菌體內沒有合成磁小體;而以琥珀酸為單一碳源時,Cmag值為(1.28±0.01).因此,AMB-1在以酒石酸、乙酸鈉和檸檬酸為單一碳源時無法合成磁小體,而能夠以琥珀酸為單一碳源合成磁小體,結果與上述結果一致.2.5不同質量濃度實驗結果從AMB-1在不同單一碳源培養(yǎng)基中的生長情況可知:相比其他碳源而言,AMB-1在只添加琥珀酸作為單一碳源的培養(yǎng)基中生長相對較好,但沒有明顯的穩(wěn)定期.因此,在此基礎上,繼續(xù)考察不同琥珀酸濃度(c(琥珀酸))對AMB-1生長的影響如圖5所示.由圖5(a)可知:在不同質量濃度的琥珀酸培養(yǎng)條件下,AMB-1的延滯期都很長(0～24h),生長進程和生物量隨著琥珀酸質量濃度變大也產生較大差異.由圖5(b)可知:在質量濃度為50,100mg·L-1時,AMB-1沒有對數(shù)生長期,同時生物量也很低,只有(0.027±0.002)和(0.024±0.005);在質量濃度為400mg·L-1時,生物量達到(0.080±0.002),但AMB-1無穩(wěn)定期;在質量濃度為200,800,1600mg·L-1時,AMB-1生長進程相似,但也都沒有明顯的穩(wěn)定期;細菌在達到生長對數(shù)期末期后,菌體數(shù)量下降較快;在質量濃度為1600mg·L-1時,AMB-1生物量達到最高(0.09±0.007).因此,在質量濃度為50～1600mg·L-1的范圍內,琥珀酸濃度均不適宜AMB-1的生長和生物量地提高.由圖5(c)可知:在不同濃度琥珀酸的培養(yǎng)條件下,AMB-1的Cmag值差異較大,與琥珀酸濃度逐漸變大的趨勢沒有一定的相關性;在質量濃度為400mg·L-1時達到最大(1.132±0.002),此時Cmag值仍然較低.因此,在質量濃度為50～1600mg·L-1范圍時,單以琥珀酸作為AMB-1碳源均不利于其體內合成磁小體.2.6以硝酸鈉為氮源的amb-1菌體及磁敏性考察不同氮源對AMB-1的生長影響,如圖6所示.3種氮源相比較,AMB-1對硝酸鈉的吸收最好,生長進程符合標準的生長曲線模式.由圖6(a)可知:0～12h為延滯期,12～44h為對數(shù)生長期,44～84h為穩(wěn)定期,84h以后進入衰退期;AMB-1對氯化銨和硫酸銨吸收較差,在氯化銨和硫酸銨作為氮源時,延滯期相對較長(0～36h),對數(shù)生長期不明顯,無穩(wěn)定期,156h后開始衰退.由圖6(b)可知:AMB-1以硝酸鈉為氮源時,穩(wěn)定期的菌體量為(0.085±0.049),要高于其他兩種氮源;而氯化銨的(0.024±0.002)略高于硫酸銨(0.021±0.003).由圖6(c)可知:硝酸鈉穩(wěn)定期時的磁敏性最高(1.295±0.01);硫酸銨次之(1.141±0.012);氯化銨最低(1.107±0.007).結果表明:AMB-1以硝酸鈉為氮源時有利于AMB-1生長,既有較高的菌體數(shù)量又有相對較多的磁小體數(shù)量;而氯化銨和硫酸銨都不利于AMB-1的生長和磁小體的合成.分析認為:硝酸鈉為氮源被細菌生長所消耗后,培養(yǎng)基pH偏若堿性;而硫酸銨和氯化銨作為氮源被消耗后,培養(yǎng)基pH偏弱酸性,不利于AMB-1的生長及磁小體的合成.2.7穩(wěn)定期對菌體數(shù)量的影響考察硝酸鈉質量濃度(ρ(硝酸鈉))對AMB-1生長的影響,如圖7所示.由圖7(a)可知:硝酸鈉質量濃度為10,50mg·L-1時,AMB-1生長進程無明顯的對數(shù)生長期;質量濃度為100,200,400mg·L-1時,硝酸鈉生長進程相似;而質量濃度為800mg·L-1的AMB-1雖然延滯期和對數(shù)生長期正常,但是沒有穩(wěn)定期,在36h達到對數(shù)生長期末期后,菌體數(shù)量迅速開始下降.原因可能是大量硝酸鈉的加入,導致其被細菌利用后,培養(yǎng)基pH值改變太大,由中性變?yōu)槠珘A性,不利于AMB-1的生長.由圖7(b)可知:硝酸鈉質量濃度為400mg·L-1時,穩(wěn)定期的菌體數(shù)量最多(0.127±0.002);而其質量濃度為10mg·L-1時,穩(wěn)定期的菌體數(shù)量最少(0.022±0.002).由圖7(c)可知:硝酸鈉質量濃度為100mg·L-1時,AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值最高(1.214±0.002),而質量濃度為800mg·L-1時,AMB-1穩(wěn)定期的Cmag值最低(1.09925±0.00075).研究結果表明:硝酸鈉質量濃度為400mg·L-1時,AMB-1雖然穩(wěn)定期的菌體數(shù)量達到最高值,但是Cmag值卻是偏低,即體內磁小體數(shù)目很少.現(xiàn)象和考察裝瓶量時結果相似,總體而言,在質量濃度為100mg·L-1添加量時有利于AMB-1的生長和磁小體的合成.2.8不同碳源比例對amb-1和酒石酸的影響在考察過不同種單一碳源以及不同琥珀酸濃度對AMB-1生長影響后,發(fā)現(xiàn)AMB-1不適于在單一碳源培養(yǎng)基中生長,因此,在