正交設(shè)計(jì)優(yōu)化l-蘋(píng)果酸發(fā)酵工藝

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化l-蘋(píng)果酸發(fā)酵工藝

l-蘋(píng)果是由生物三氧化反應(yīng)及其器官乙酰酸反應(yīng)的中間產(chǎn)物，也是由二氧化碳固定反應(yīng)的中間產(chǎn)物。在植物的生理代謝過(guò)程中，它位于中心位置。它在食品工業(yè)、臨床醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)和飼料工業(yè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用很活躍都十分重要,充分顯示出其積極意義。蘋(píng)果酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、發(fā)酵法、轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)的蘋(píng)果酸在應(yīng)用上受到限制。轉(zhuǎn)化法主要是固定化酶和固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化。20世紀(jì)80年代末以來(lái),對(duì)轉(zhuǎn)化工藝的研究獲得突破,并成功地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。而發(fā)酵法生產(chǎn)蘋(píng)果酸的研究還未有重大進(jìn)展,非糖質(zhì)原料發(fā)酵法尚處于實(shí)驗(yàn)室水平。糖質(zhì)原料發(fā)酵法工藝中,一步發(fā)酵法和混合發(fā)酵法都有較大進(jìn)展,但有關(guān)的研究報(bào)道尚少。而混合發(fā)酵法由于涉及到兩種微生物,培養(yǎng)條件要求比較嚴(yán)格,發(fā)酵周期較長(zhǎng),產(chǎn)酸率較低,副產(chǎn)物較多。因此,本文采用米曲霉發(fā)酵糖質(zhì)原料生成蘋(píng)果酸,通過(guò)對(duì)發(fā)酵溫度、接種量、起始糖濃度及碳酸鈣加入量的優(yōu)化,以淀粉水解液為原料,其產(chǎn)酸水平最高可達(dá)80.6g/L。1材料和方法1.1病毒米曲霉(Aspergillusoryzae)。1.2培養(yǎng)基1.2.1自然ph5.55.5選用PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基200.0g,葡萄糖20.0g,瓊脂2.5%,水1000mL,自然pH(5.5~6.5)。將馬鈴薯洗凈,去皮,切成碎塊,立即放入水中煮沸1h,用6層紗布過(guò)濾,加入葡萄糖和瓊脂,加水配成1000mL溶液,加熱煮沸、分裝試管、加塞標(biāo)記、高壓殺菌后備用。1.2.2酶系統(tǒng)論豆餅粉6.0,蔗糖2.0,NaNO30.3,K2HPO40.1,KCL0.1,MgSO4·7H2O0.03,FeSO4·7H2O0.05。加水至100.0mL,于三角瓶中120℃、0.1MPa濕熱滅菌,方法同上。1.2.3khpo,mnso-4,防范khpo3,防范kp3,mnso3.3,4,4.3,4.2,4-5-5-4.3,4.2.3,4.3,4.2研究方法單獨(dú)滅菌,6.豆餅粉0.5,FeSO4·H2O0.01,CaCl20.01,K2HPO40.01,MgSO4·H2O0.01,MnSO40.05,(NH4)2SO40.2,葡萄糖8.0~13.0,CaCO36.5~8.5(單獨(dú)滅菌),方法同上。1.3種子培養(yǎng)條件斜面培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30℃,培養(yǎng)時(shí)間24h。種子培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30℃,培養(yǎng)時(shí)間3d,搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度32~38℃,搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min。1.4蘋(píng)果酸的測(cè)定蘋(píng)果酸定性檢測(cè)采用三氯化鈦法:將5.0mL待測(cè)溶液注入試管,再加3滴15%TiCl3試劑。如有白色沉淀產(chǎn)生說(shuō)明溶液中存在蘋(píng)果酸,當(dāng)溶液中含有檸檬酸時(shí)以不加熱為妥。蘋(píng)果酸定量檢測(cè)采用紫外分光光度法:取含樣品溶液1.0mL,加入6.0mL分析純的濃硫酸,再加入0.1mL2,7-萘二酚溶液,接著在100℃水浴中加熱15~20min,取出,待冷卻至室溫后,于385nm下進(jìn)行比色測(cè)定,根據(jù)測(cè)得的吸光度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得蘋(píng)果酸含量,將紙層析顯色后的樣品斑點(diǎn),剪下后置于1mL水中洗脫,然后將其作為樣品溶液按上法處理,也可測(cè)得蘋(píng)果酸含量。此外,用酸度計(jì)測(cè)定pH,用快速測(cè)定法測(cè)定殘?zhí)恰?結(jié)果與討論2.1接種時(shí)間對(duì)米曲霉菌生長(zhǎng)的影響根據(jù)米曲霉生長(zhǎng)曲線(xiàn),在培養(yǎng)至30h開(kāi)始產(chǎn)生孢子,39~75h為指數(shù)期,所以發(fā)酵接種時(shí)間應(yīng)該控制在米曲霉生長(zhǎng)2.5d時(shí)。在不同的接種量下,米曲霉菌株產(chǎn)L-蘋(píng)果酸情況見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,接種量為8.0%時(shí)產(chǎn)酸率最高。接種量太高會(huì)造成菌絲結(jié)團(tuán)從而影響通氧過(guò)程,接種量太低會(huì)使發(fā)酵不充分影響產(chǎn)酸過(guò)程。2.2發(fā)酵溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)量l-蘋(píng)果酸的影響在不同的發(fā)酵溫度下,米曲霉菌株產(chǎn)L-蘋(píng)果酸情況見(jiàn)圖2。從圖2可以看出,米曲霉菌株的最適發(fā)酵溫度范圍在34~36℃。2.3淀粉水解液濃度對(duì)米曲霉菌產(chǎn)酸的影響米曲霉菌株的碳源適應(yīng)范圍比較廣,液化淀粉、葡萄糖、淀粉水解液都是較好的碳源,考慮到以水解糖為原料更有利于產(chǎn)品的后提取,因此選用淀粉水解液為發(fā)酵碳源,同時(shí),淀粉原料來(lái)源豐富,采用雙酶制糖工藝技術(shù)成熟、質(zhì)量可靠。將淀粉水解液配制成不同的濃度,考察米曲霉菌株的產(chǎn)酸情況,結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著糖濃度的增加,產(chǎn)酸逐漸增加,起始糖濃度為100.0g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。初糖濃度高于此值時(shí),轉(zhuǎn)化率降低,發(fā)酵殘?zhí)瞧摺＞C合考慮產(chǎn)酸、殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期等指標(biāo)的前提下,將糖濃度控制在100.0g/L為佳。2.4培養(yǎng)基中caco3對(duì)產(chǎn)酸的影響在發(fā)酵中碳酸鈣會(huì)和生成的蘋(píng)果酸反應(yīng)生成難溶的蘋(píng)果酸鈣,從而達(dá)到減弱對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制,使代謝向著生成和積累蘋(píng)果酸的方向進(jìn)行。同時(shí),L-蘋(píng)果酸與碳酸鈣反應(yīng)放出CO2,為CO2固定支路提供CO2,利于L-蘋(píng)果酸的生成。因此,培養(yǎng)基中CaCO3的存在是L-蘋(píng)果酸有效積累的必要條件。CaCO3對(duì)產(chǎn)酸的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:碳酸鈣用量對(duì)產(chǎn)酸的影響較大,培養(yǎng)基中不添加碳酸鈣時(shí),幾乎不產(chǎn)酸,隨著碳酸鈣濃度的增加,產(chǎn)酸水平也相應(yīng)提高,在初糖濃度不變的情況下,碳酸鈣適當(dāng)過(guò)量有利于產(chǎn)酸,當(dāng)碳酸鈣的添加超過(guò)一定的量時(shí)產(chǎn)酸趨于不變。初糖濃度為100g/L時(shí),經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明碳酸鈣的用量為75g/L比較合適。2.5d、t因素對(duì)l-蘋(píng)果酸主發(fā)酵條件的影響在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn),考察接種量、發(fā)酵溫度、起始糖濃度和CaCO3添加量4因素對(duì)米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋(píng)果酸的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3、表4。從表4可看出,最優(yōu)方案為A1B2C2D2,即發(fā)酵溫度34℃、初糖濃度100g/L、接種量8.0%、碳酸鈣添加量75g/L。還知D因素的極差RD=27.1最大,表明D因素對(duì)L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)率影響程度最大;A因素的極差RA=2.2最小,說(shuō)明溫度對(duì)L-蘋(píng)果酸產(chǎn)率的影響程度最小;B、C因素的極差居中,說(shuō)明B、C因素對(duì)L-蘋(píng)果酸產(chǎn)率有一定的影響,但是影響程度較D因素小。3菌株復(fù)配和工藝條件對(duì)米曲霉最適產(chǎn)酸水平的影響實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)發(fā)酵溫度、接種量、起始糖濃度及碳酸鈣添加量的優(yōu)化,確定利用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度為34℃、起始糖濃度為100g/L、接種量為8.0%、碳酸鈣添加量為75g/L,該條件下最高產(chǎn)酸水平可達(dá)80.6g/L。與報(bào)道中最高水平有一些差距,分析認(rèn)為是因所選菌種非高產(chǎn)菌株,一步發(fā)酵的關(guān)鍵應(yīng)該放在選育高產(chǎn)菌株和工藝條件的控制上。另外碳酸鈣的加入雖然可以