雙酶法水解米渣蛋白工藝研究

雙酶法水解米渣蛋白工藝研究

米渣是由大米生產(chǎn)的實驗廠、葡萄糖廠、廠和麥芽糊精廠的副產(chǎn)品?，F(xiàn)在主要用于飼料處理。米渣主要成分是蛋白質(zhì)和碳水化合物,且蛋白質(zhì)含量很高(40%以上),遠高于大米甚至大豆中蛋白含量,是良好蛋白資源。米渣蛋白質(zhì)主要是胚乳蛋白,由清蛋白(4%~9%)、鹽溶性球蛋白(10%~11%)、醇溶性谷蛋白(3%)和堿溶性谷蛋白(66%~78%)組成。有研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)并非需在腸道徹底水解為游離氨基酸后才能被機體所吸收利用,而主要是以短肽形式被吸收,且機體對短肽吸收代謝速度較游離氨基酸為快。這些小分子量肽經(jīng)人體消化道時不被水解,而直接被人體吸收利用,且呈有各種各樣生物活性,發(fā)揮特殊生理調(diào)節(jié)作用。因此,利用米渣提取蛋白并生產(chǎn)小分子多肽,不僅可提高米渣利用價值,變廢為寶,產(chǎn)生更大經(jīng)濟效益,且對增進人體健康具有積極推動作用。1材料和方法1.1生化酶活力單位g/g米渣:湖南華湘米業(yè)有限公司,粉碎后過80目篩;堿性蛋白酶(酶活力單位200,000u/g):丹麥諾維信公司;中性蛋白酶(酶活力單位50,000u/g):丹麥諾維信公司;胰蛋白酶(酶活力單位8,000u/g):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;菠蘿蛋白酶(酶活力單位300,000u/g):丹麥諾維信公司;1.2xj–b型離子儀ZN–400A型中藥粉碎機:長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠;LXJ–ⅡB型離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;pHS–3C型精密pH計:梅特勒―托利多儀器有限公司;E02140型電子分析天平:上海雷磁儀器廠;1.3學(xué)習(xí)方法1.3.1最佳蛋白酶的確定首先采用不同蛋白酶對米渣蛋白進行初步酶解,選擇酶解能力最強蛋白酶。選用蛋白酶包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶;然后選用酶解效果較優(yōu)兩種酶分別進行單因素試驗,找出酶解最佳條件,同時測定酶解后水解度。1.3.2米渣蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)氨基態(tài)氮測定:甲醛滴定法;總氮測定:凱式定氮法(GB6432–1986,據(jù)FAO1947規(guī)定米渣蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)用6.25,由于水溶性非蛋白氮被水洗滌帶走,因此蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)高于米粉蛋白轉(zhuǎn)化系數(shù)5.95。)水解度(%)=酶解液氨基態(tài)氮/總氮×100%蛋白質(zhì)提取率(%)=酶解液總氮/米渣總氮×100%2結(jié)果與討論2.1量表1:多元,程序不統(tǒng)一,單次運行以量為鑒采用凱式定氮法測定米渣蛋白中蛋白含量為41.58%。通過米渣預(yù)處理,即90℃高溫水洗兩次,糖化酶酶解一次后米渣中蛋白含量提高到78.30%。2.2酶解劑的篩選將經(jīng)預(yù)處理米渣,分別與堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶在各自適合酶解條件下(酶量均為8,000u/g)進行酶解,測定其蛋白提取率及水解度。酶解結(jié)果見表1。從表1可知,堿性蛋白酶和中性蛋白酶對米渣蛋白酶解效果較優(yōu);但從提取率和水解度來看,單獨使用一種酶其得率依然較低。2.3濾渣的酶解及加酶順序?qū)λ舛鹊挠绊懹捎趩为毷褂靡环N酶提取率和水解度并不高,嘗試采用兩種酶結(jié)合酶解,以進一步提高提取率和水解度。首先采用一種酶進行酶解(酶解條件參照表1),然后離心過濾,測定上清液水解度及提取率;濾渣用第二種酶再次進行酶解(酶解條件參照表1),同樣離心過濾,測定水解度及提取率,酶解時添加酶量均為8,000u/g。另外,加酶先后順序?qū)Y(jié)果也有一定影響,故將兩種加酶順序通過試驗進行對比,結(jié)果見表2。由表2可看出,先加堿性蛋白酶再加中性蛋白酶,其水解效果和蛋白提取率均比先加中性蛋白酶再加堿性蛋白酶時為好。原因可能是在堿性環(huán)境下,更多堿溶性蛋白能從米渣中溶出,增加蛋白酶與之接觸面積,故而能更好酶解,提高水解度。2.4單因素堿性酶試驗2.4.1溫度對水解度的影響圖1為在pH值10、固液比1∶10、酶量8,000u/g、時間3h時,改變反應(yīng)溫度而得到水解度曲線。從圖1可看出,在溫度為55℃時,酶水解度最高。2.4.2反應(yīng)ph值對水解度曲線的影響圖2為在溫度55℃、固液比1∶10、酶量8,000u/g、時間3h時,改變反應(yīng)pH值而得到水解度曲線。從圖2可看出,在pH值為10時,酶水解度最高。2.4.3加酶量的確定圖3為在溫度55℃、固液比1∶10、pH為10、時間3h時,改變反應(yīng)加酶量而得到水解度曲線。從圖3可看出,在加酶量為8,000u/g時,水解度最高。但從圖中也可看出,從6,000u/g開始,隨加酶量提高,水解度變化趨勢已不大;從節(jié)約成本角度,考慮選擇加酶量以6,000u/g為宜。2.4.4水解度曲線的繪制圖4為在溫度55℃、固液比1∶10、pH為10、酶量8,000u/g時,改變水解時間而得到水解度曲線。從圖4可看出,在水解時間為4h時,隨時間延長,水解度變化趨勢已不大,為節(jié)省時間、提高效率,水解時間為4h即可。2.4.5溶液濃度對酶解效果的影響圖5為pH值為10、溫度55℃、酶量8,000u/g、時間3h時,改變固液比而得到水解度曲線。從圖5可看出,當(dāng)溶液濃度太高時,酶與底物都無法充分在水中分散,反應(yīng)體系要經(jīng)較長一段時間才能均勻,從而使酶與底物結(jié)合難度加大,不利于酶解。而當(dāng)溶液濃度過低時,酶分子又不能全部與底物蛋白結(jié)合,使酶解反應(yīng)不充分,從而影響酶解效率。故要選擇最佳固液比,使酶與底物能充分結(jié)合,經(jīng)試驗得出,最佳固液比為1∶15。2.4.6m渣蛋白水解酶解方法按照單因素試驗得到條件,即堿性蛋白酶在溫度為55℃、pH值為10、酶量為6,000u/g、時間為4h、固液比為1∶15時進行酶解,得出堿性蛋白酶水解米渣蛋白水解度為9.01%。2.5單因素初級酶試驗對經(jīng)堿性蛋白酶酶解米渣蛋白酶解液進行離心,取沉淀后加入中性蛋白酶繼續(xù)進行酶解。2.5.1反應(yīng)溫度對水解度曲線的影響圖6為在pH值7.0、固液比1∶10、酶量8,000u/g、時間3h時,改變反應(yīng)溫度而得到水解度曲線。從圖6可看出,當(dāng)溫度為50℃時,水解度最高。2.5.2不同加酶量對水解度的影響圖7為在pH7.0,固液比1∶10、溫度50℃、時間3h時,改變反應(yīng)加酶量而得到水解度曲線。從圖7可看出,酶量從6,000u/g開始增加時,水解度變化趨勢已不明顯,從節(jié)約成本角度,考慮選擇加酶量以6,000u/g為宜。2.5.3反應(yīng)時間對水解度的影響圖8為在pH7.0、固液比1∶10、溫度50℃、加酶量8,000u/g時,改變反應(yīng)時間而得到水解度曲線。從圖8可看出,在時間為3h后,隨時間延長,水解度變化趨勢也已不明顯,為節(jié)省時間、提高效率,水解時間宜為3h即可。2.5.4固液比的影響圖9為在pH7.0、溫度50℃、酶量8,000u/g、時間3h時,改變固液比而得到水解度曲線。同堿性蛋白酶一樣,從圖9可看出,當(dāng)溶液濃度太高時,中性蛋白酶與底物結(jié)合難度加大,不利于酶解;而當(dāng)溶液濃度過低時,酶分子又不能全部與底物蛋白結(jié)合,從而影響酶解反應(yīng)。經(jīng)試驗,選擇最佳固液比為1∶15。2.5.5正交試驗結(jié)果由于酶解條件對酶解效果影響在一定范圍內(nèi)呈逐漸變化,因此,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,取單因素試驗最佳水平條件,確定為正交試驗各因素水平,見表1。在pH值確定情況下,影響酶解因素為溫度、加酶量、時間、固液比。本實驗采用4水平3因素正交試驗,pH值為7,以各條件下水解度為指標。由表4正交試驗結(jié)果與分析可看出,對于酶解而言,最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2,即溫度50℃、酶量7,000u/g、時間5h,固液比為1∶15時,酶解效果最好,各因素影響主次順序依次為溫度>時間>加酶量>固液比。驗證試驗:按照A2B2C2D2條件進行驗證試驗,即溫度50℃,酶量7,000u/g、時間5h、固液比為1∶15條件下,中性蛋白酶水解米渣蛋白水解度為7.82%。2.6第一次酶解+冷卻稱取一定量經(jīng)預(yù)處理后米渣原料,首先按堿性蛋白酶最佳酶解條件,即溫度55℃、pH值10,酶量6,000u/g、時間4h進行第一次酶解;達到酶解時間后,高溫滅酶10min,冷卻后調(diào)pH為7.0;然后加入中性蛋白酶,在溫度50℃、酶量7、000u/g、固液比1∶15時,進行第二次酶解,5h后,高溫滅酶冷卻,離心取上清液,即為米渣蛋白酶解液,測定水解度為15.28%。3堿性蛋白酶酶解米渣蛋白通過對堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶這四種酶酶解試驗分析,發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶和中性蛋白酶對米渣蛋白酶解效果較