第十二章 病毒的分子生物學(xué)

第十二章病毒的分子生物學(xué)

12.1病毒分子生物學(xué)研究的內(nèi)容

病毒分子生物學(xué)是用現(xiàn)代分子生物學(xué)的新理論、新技術(shù)和新方法對病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能，基因組的復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控，病毒與宿主的相互作用關(guān)系等進(jìn)行研究的一門學(xué)科。

人類對病毒的研究成果在現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展史上，做出了重大的貢獻(xiàn)。許多分子生物學(xué)上的重大突破都是以病毒作為模式或研究材料而進(jìn)行的。

其研究成果除了揭示許多重要的分子生物學(xué)過程之外，對人類認(rèn)識病毒感染、致病的分子本質(zhì)，為病毒引起疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)，促進(jìn)了基因工程疫苗和抗病毒藥物的研制和發(fā)展。

病毒分子生物學(xué)研究領(lǐng)域12.1.1病毒基因組的結(jié)構(gòu)12.1.2病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)調(diào)控12.1.3病毒對宿主細(xì)胞的影響12.1.4病毒與腫瘤發(fā)生12.1.5病毒的基因工程疫苗與病毒載體12.1.1病毒基因組的結(jié)構(gòu)不同類型的病毒，其基因組有很大差異。在核酸類型上，有DNA病毒(如腺病毒)，有RNA病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒)，但對每一種病毒來說，它只能含有一種核酸。從核酸結(jié)構(gòu)上看，有的是單鏈核酸，有的是雙鏈核酸，有的是線狀，有的是環(huán)狀。一些單鏈RNA病毒的基因組還具有不同的極性，有的是正鏈RNA，有的是負(fù)鏈RNA。

有的正鏈RNA病毒基因組5′端有帽子結(jié)構(gòu)，也有的正鏈RNA病毒基因組3′端有poly(A)尾結(jié)構(gòu)。

相對于能獨(dú)立生活的微生物來說，病毒的基因組非常簡單。病毒核酸的相對分子質(zhì)量約為1.6×107～1.6×108，僅為一般細(xì)菌基因組的1‰～l/10。

12.1.2病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)調(diào)控病毒進(jìn)入活的易感宿主細(xì)胞后，借助于宿主細(xì)胞本身提供的原料、能量、酶等，以自我復(fù)制的方式進(jìn)行繁殖。病毒基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程。正鏈RNA病毒的基因組除了作為模板復(fù)制出子代RNA之外，還有mRNA的作用。作為翻譯的模板，一般先翻譯出單一的大分子肽鏈，然后再由蛋白酶降解為不同功能的結(jié)構(gòu)蛋白等。

負(fù)鏈RNA病毒的基因組無mRNA的功能，必須由復(fù)制出的互補(bǔ)RNA(cRNA)來發(fā)揮mRNA的作用。

12.1.3病毒對宿主細(xì)胞的影響病毒只能在活細(xì)胞中存活，因此，病毒與宿主細(xì)胞之間有著十分密切的關(guān)系。病毒利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞器、能量和酶等進(jìn)行自身的復(fù)制，并通過宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)自身所需的蛋白質(zhì)，這些過程都將會對宿主細(xì)胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生重大的影響。

病毒對宿主細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在病毒對宿主細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響以及病毒對宿主細(xì)胞功能的影響兩個(gè)方面。

12.1.4病毒與腫瘤發(fā)生人類和動物腫瘤的形成除了與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)外，某些DNA和RNA病毒也可以通過不同的機(jī)制誘發(fā)惡性腫瘤。有些病毒直接作用于細(xì)胞的基因組，使細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致腫瘤形成；有些病毒則通過抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，形成腫瘤。有些病毒常伴隨一些特定腫瘤的發(fā)生，但它們與腫瘤的關(guān)系還未得到確認(rèn).例如在艾滋病病人中引發(fā)的Kaposi‘s肉瘤。總之，大約15%的惡性腫瘤與病毒有關(guān)，因此研究腫瘤的病毒病因具有十分重要的意義。12.1.5病毒基因工程疫苗與病毒載體基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表達(dá)病原微生物的一段基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物(多數(shù)是無毒性、無感染能力，但具有較強(qiáng)的免疫原性)用作疫苗，例如正在使用的大多數(shù)乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。常見的基因工程疫苗包括亞基疫苗和肽疫苗兩類。以流感疫苗為例，其途徑就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出來，再制備cDNA,克隆到大腸桿菌中，高效表達(dá)該抗原。

由于基因工程疫苗具有安全性好、產(chǎn)量高、成本低，以及良好的免疫原性，它必將成為傳統(tǒng)疫苗的有效替代疫苗。

12.2DNA病毒的分子生物學(xué)DNA病毒基因組有單鏈和雙鏈兩種結(jié)構(gòu)，并以線狀或環(huán)狀形式存在，大部分為單一分子，也有的由數(shù)個(gè)片段的DNA分子構(gòu)成分段的基因組。

動物DNA病毒多為雙鏈DNA基因組，腺病毒、痘病毒、皰疹病毒都是雙鏈線狀DNA基因組，末端有重復(fù)序列，經(jīng)退火能形成環(huán)形分子。腺病毒(Aflenovirus)是一種典型的雙鏈DNA病毒，下面以腺病毒的基因表達(dá)調(diào)控為例，簡要介紹DNA病毒的分子生物學(xué)。

12.2.1腺病毒的發(fā)現(xiàn)1953年，Rowe等人從外科手術(shù)摘除的兒童腺體中分離到一種致病因子，可以使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生慢性進(jìn)行性病變，稱之為腺體退化因子，后來證明這種致病因子是病毒，1956年，Enders等建議命名為腺病毒。

腺病毒分布十分廣泛，從各種胎生哺乳動物、鳥類和兩棲類動物中都已分離到。腺病毒科分兩個(gè)屬：1、哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)2、禽腺病毒屬(Ariadenovirus)。

腺病毒感染細(xì)胞后可關(guān)閉宿主細(xì)胞某些基因的表達(dá)，大量合成病毒蛋白質(zhì)，致使細(xì)胞的功能失常。腺病毒致癌的分子機(jī)理是目前分子病毒學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。

12.2.2腺病毒的毒粒結(jié)構(gòu)

完整的腺病毒顆粒其相對分子質(zhì)量1.7×108-1.85×108，沉降常數(shù)約560S，在CsCl中的密度為1.32～1.35g/cm3。腺病毒對熱和酸穩(wěn)定，能在腸道中存活。腺病毒顆粒無包膜，外邊是蛋白外殼，中間為緊密的核心顆粒，內(nèi)含單一拷貝的雙鏈DNA。

12.2.3腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)

腺病毒基因組為線形雙鏈DNA，人類腺病毒基因組包括早期基因E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4以及晚期基因L1、L2、L3、L4和L5。

12.2.4腺病毒的復(fù)制

12.2.5腺病毒的基因轉(zhuǎn)錄

12.2.6腺病毒與腫瘤至今尚未發(fā)現(xiàn)腺病毒感染與任何人類腫瘤的關(guān)系。但許多的人類腺病毒卻可以使嚙齒動物的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或使這些動物產(chǎn)生腫瘤。

12.2.7腺病毒作為基因治療的載體

腺病毒用作基因治療載體和疫苗研制有著廣闊的前景。腺病毒基因組的E1區(qū)和E3區(qū)可以作為外源基因的插入?yún)^(qū)。E1區(qū)缺失的腺病毒可克隆約4.7kb的外源DNA，而E3區(qū)缺失的腺病毒可以克隆約8kb的外源DNA，一些特定的腺病毒株已被用于人類疫苗的研制。

腺病毒作為基因治療載體有著以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)腺病毒基因組研究的比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作。(2)其感染一般不引起明顯的癥狀，與宿主染色體整合的機(jī)率很低，作為基因治療的載體比較安全。

(3)可以感染不同類型細(xì)胞，易于進(jìn)行體外培養(yǎng)，病毒感染細(xì)胞滴度高，可在細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制。(4)腺病毒感染細(xì)胞后可以高水平的表達(dá)蛋白，在感染后期，宿主基因表達(dá)被關(guān)閉，易于高水平表達(dá)外源基因。

12.3RNA病毒的分子生物學(xué)

RNA病毒基因組均呈線狀，有單雙鏈之分，有單一分子，也有的基因組是分段的。RNA的二級結(jié)構(gòu)對病毒基因表達(dá)調(diào)控有重要影響。

下面介紹一種典型的RNA病毒，黃病毒科丙型肝炎病毒屬的成員——丙型肝炎病毒(HCV)。

12.3.1HCV的發(fā)現(xiàn)

丙型肝炎病毒HCV(hepatitisCvirus)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對病毒進(jìn)行研究的成功實(shí)例。

12.3.2HCV基