分子生物常用技術(shù)未修改

第六章常用分子生物學(xué)技術(shù)1.掌握：常用分子生物學(xué)技術(shù)的基本概念與基本原理。2.熟悉：常用分子生物學(xué)的基本方法。3.了解：常用分子生物學(xué)技術(shù)研究進展以及在藥學(xué)中的應(yīng)用。第一節(jié)分子雜交技術(shù)一、核酸分子雜交的基本原理二、核酸探針及標(biāo)記三、核酸分子雜交的應(yīng)用

Southern印跡Northern印跡Western印跡原位雜交生物芯片

原理分子雜交技術(shù)是利用單鏈核酸堿基互補配對，抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其它分子的相互作用進行目的核酸、蛋白檢測的技術(shù)。DNA變性在某些因素的作用下，雙鏈間氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，形成無規(guī)則線團狀分子的過程。本質(zhì)是雙鏈間的氫鍵的斷裂

變性的DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的DNA單鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。變性復(fù)性復(fù)性：變性的逆過程。復(fù)性在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子定義：核酸探針是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。二、核酸探針及標(biāo)記動畫制備特異性探針?biāo)枰幕緱l件1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；2.有明確的基因產(chǎn)物;具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。探針?biāo)鶖y帶的標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：標(biāo)記后的探針的分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原來的分子結(jié)構(gòu)相同，絕不影響其堿基配對特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。標(biāo)記探針的檢測方法簡便、省時、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高。穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價廉。常用的探針標(biāo)記物：放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。三、分子雜交的應(yīng)用Southern印跡法Northern印跡Western印跡法原位雜交生物芯片一、Southern印跡雜交1975年，英國Southern創(chuàng)建DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進行檢測的方法。Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測SouthernBlot-+動畫二、Northern印跡雜交(Northernbloting)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。特點能在成分復(fù)雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高核酸原位雜交的基本步驟細胞或組織的固定：載玻片組織細胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測利用FISH技術(shù)診斷Down綜合征圖示：利用21號染色體特異性探針對一位高齡妊娠婦女進行產(chǎn)前診斷，未培養(yǎng)的羊水細胞進行熒光原位雜交,顯示所檢測的細胞均有3個雜交信號,經(jīng)選擇性人工流產(chǎn)后確診為Down綜合征患兒。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室三、Westernblotting免疫印跡(Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)是檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的一項十分有效的方法。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室蛋白質(zhì)樣品電泳非標(biāo)記抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)熒光素酶或放射性同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）方法：MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室WesternBlotting

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室10/16/2023242.蛋白質(zhì)印跡法用于二級抗體的檢測有以下三種：放射性標(biāo)記的抗體與酶偶聯(lián)的抗體與生物素相偶聯(lián)的抗體25PTBBeta-actin---P+P++P+++P++++AproteingelstainedbyCoomassieBlueWesternanalysisusingtwospecificantibodies三種印跡技術(shù)的比較五、DNA芯片技術(shù)的概念基因芯片(Genechip)技術(shù)是指通過微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。基因芯片A.用于微陣列芯片制作的點樣儀。；B.封裝在卡盒中的微陣列芯片;C.用于微陣列芯片熒光標(biāo)記檢測的激光共聚焦掃描器；D.微陣列芯片的局部放大；E.微陣列芯片上固定DNA探針的示意圖。圖中藍色的DNA鏈?zhǔn)穷A(yù)先固定在芯片表面的捕獲探針，紅色的DNA鏈?zhǔn)桥c捕獲探針互補的靶DNA分子。生物芯片分析過程試樣處理點陣固定反應(yīng)或雜交芯片制作標(biāo)記洗滌檢測掃描光刻合成微量點樣噴墨純化、標(biāo)記光化學(xué)檢測電化學(xué)檢測計算處理生物芯片技術(shù)的應(yīng)用

applicationsofbiochiptechnology1.1998年底美國科學(xué)促進會將基因芯片技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進展之一，足見其在科學(xué)史上的意義。基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種疾病。如應(yīng)用于產(chǎn)前遺傳性疾病檢查，抽取少許羊水就可以檢測出胎兒是否患有遺傳性疾病，同時鑒別的疾病可以達到數(shù)十種甚至數(shù)百種，這是其他方法所無法替代的，非常有助于“優(yōu)生優(yōu)育”這一國策的實施。。又如對病原微生物感染診斷，目前的實驗室診斷技術(shù)所需的時間比較長，檢查也不全面，醫(yī)生往往只能根據(jù)臨床經(jīng)驗做出診斷，降低了診斷的準(zhǔn)確率，如果在檢查中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，醫(yī)生在短時間內(nèi)就能知道病人是哪種病原微生物感染；而且能測定病原體是否產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素產(chǎn)生耐藥性、對哪種抗生素敏感等等，這樣醫(yī)生就能有的放矢地制定科學(xué)的治療方案；生物芯片技術(shù)的應(yīng)用再如對具有高血壓、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接觸毒化物質(zhì)人群惡性腫瘤普查等等，如采用了基因芯片技術(shù)，立即就能得到可靠的結(jié)果，其他對心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、代謝性疾病等，如采用了基因芯片技術(shù)，其早期診斷率將大大提高，而誤診率會大大降低，同時有利于醫(yī)生綜合地了解各個系統(tǒng)的疾病狀況第二節(jié)目的基因制備技術(shù)一、PCR技術(shù)PCR技術(shù)：是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。經(jīng)n次擴增后,一個DNA分子可變?yōu)?n個DNA分子。其中目的片斷為2n-2n，非目的片斷為2n。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)；1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室OUTLINE3concepts5EssentialComponents3stepsOnesentence

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室3ConceptsofthePCRDenaturation:

變性Renaturation：復(fù)性3.Semiconservativereplication：半保留復(fù)制thedoublestrand

DNAopentosinglestrandedDNAtwosinglestrandedDNAformdoublestrand

DNAreplication,onemaketwoMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室Semi-conservativereplicationOldnewMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室5

EssentialComponentsofPCRReaction

salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室Taq

DNAPolymeraseTaq:Thermus

aquaticus

2.95℃,T1/2(halflife)40min3.PolymerizationMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室Polymerization

聚合反應(yīng)Taq

PolymerasedTdAdGdCdT5’3’3’5’ATaq

polymerase:

72℃,2,000～4,000bases/minMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室threesteps:HowPCRworksDenaturation

(變性):90～97℃Annealing

(退火):45～55℃Extension

(延伸):

around72℃MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:Denaturation

變性94℃

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:Annealing

退火T

℃

primer-dependent

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:Extension

延伸72℃CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATCGCGATATTACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.Denaturation2.Annealing3.ExtensionPCR.EXEMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室LastStep:72

℃

2minAfter25~30cycles?MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室OnesentenceOnemakestwo,twomakefour,fourmakeanything一生二，二生四，四生萬物MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察1-2

小時5、PCR應(yīng)用MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室二、cDNA噬菌粒文庫基因文庫的類型基因組文庫：由某種生物體總?cè)旧wDNA組成的文庫。cDNA文庫：代表特定細胞或組織中mRNA的文庫。

一個細胞在任何時間可以產(chǎn)生幾千種不同的蛋白質(zhì)，所有的蛋白質(zhì)都有相應(yīng)的mRNA分子。為了鑒別其中任何一個mRNA分子，每一單獨mRNA的克隆都得考慮，但是mRNA不能直接用于克隆，因為它很不穩(wěn)定，因此，可以合成與選定組織中所有mRNA互補的DNA分子（complementaryDNA，cDNA）。MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室高質(zhì)量mRNA的制備反轉(zhuǎn)錄生成cDNA與噬菌粒載體分子相連接噬菌粒的包裝建立cDNA噬菌粒文庫的主要步驟MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室1、高質(zhì)量mRNA的制備用試劑盒提取總RNA加入與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育加入與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室2、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以寡聚dT或隨機6核苷酸為引物反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準(zhǔn)備與載體連接MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室為了得到有方向性的cDNA應(yīng)該接上不同的接頭加入帶有酶切位點的寡聚dT引物高活性的反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈合成cDNA第二鏈用RNaseH分解RNA鏈加EcoRI接頭用XhoI內(nèi)切酶切割得到雙接頭有方向性的cDNA(5'C↓TCGAG)MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室3、與噬菌體載體分子相連接帶有接頭的cDNA噬菌粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶切割含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNAMolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室4、噬菌粒的包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA體外蛋白質(zhì)外殼的包裝反應(yīng)有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體進行基因組學(xué)的研究含有某種組織或器官的噬菌粒文庫MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室目的基因篩選MolecularBiology生命科學(xué)技術(shù)系細胞生物及遺傳學(xué)教研室10/16/2023南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院62第三節(jié)基因敲除技術(shù)1.基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列。現(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸╣eneknock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。10/16/202362南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.基本原理基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp