第十三章 生化藥物與基因工程藥物分析

第十三章生化藥物和基因工程藥物

分析概念

基本要求概述質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法常用定量分析方法及其應(yīng)用

練習(xí)與思考

返回主目錄基本要求

1．了解生化藥物的定義、生化藥物分析的特點(diǎn)、生化藥物分析的進(jìn)展2．熟悉生化藥物分析的方法3．掌握常用定量分析方法（酶法、電泳法、生物檢定法、理化法）的基本原理返回

一、防病、治病的三大藥源

1．生化藥物：例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。2.生物合成藥物由微生物代謝所產(chǎn)生的必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物例：抗生素、生物堿、甾體激素、維生素、酶及輔酶類藥物3.生物制品以微生物、細(xì)胞、動(dòng)物或人源組織和體液等為原料運(yùn)用傳統(tǒng)技術(shù)或現(xiàn)代生物技術(shù)制成用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷例如：細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素、抗血清、生長因子、單克隆抗體等DNA重組技術(shù)（基因工程）：生產(chǎn)過程為天然基因合成的核苷酸序列內(nèi)切酶連接酶載體重組的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞增殖、表達(dá)分離純化目的產(chǎn)物二、生物制品的種類和特點(diǎn)1.疫苗類藥物定義：用病毒或者立克次體接種于動(dòng)物、雞胚，或經(jīng)組織培養(yǎng)后加以處理制造而成分類⑴細(xì)菌類疫苗由有關(guān)的細(xì)菌、螺旋體或者其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等例如：人用狂犬疫苗、吸附破傷風(fēng)疫苗、乙型腦炎滅活疫苗、乙型腦炎減毒疫苗等⑵病毒類疫苗由病毒，立克次體或其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等例如：流感全病毒滅活疫苗、重組乙肝炎疫苗等⑶聯(lián)合疫苗兩種或兩種以上疫苗原液按一定的比例配合制成的具有多種免疫原性的滅活疫苗或活疫苗例如：傷寒副傷寒甲乙聯(lián)合疫苗等⑷雙價(jià)及多價(jià)疫苗由單一型抗原成分組成的疫苗稱為單價(jià)疫苗。由兩個(gè)或兩個(gè)以上同一種但不同型抗原合并組成的含有雙價(jià)或多價(jià)抗原成分的疫苗，則分別稱為雙價(jià)疫苗和多價(jià)疫苗例如：雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗2.抗毒素及抗血清的藥物凡用細(xì)菌類毒素或毒素免疫馬或其他大動(dòng)物所取得的免疫血清叫抗毒素例如：破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素等凡用細(xì)菌或病毒本身免疫馬馬或其他大動(dòng)物所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清例如：抗五步蛇血清、抗銀環(huán)蛇毒血清等人體不用自身制造抗體，就可以獲得免疫力屬于“人工被動(dòng)免疫”，制劑稱為“被動(dòng)免疫制劑”3.血液制品由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離提純或者重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白組分，以及血液細(xì)胞有形成分，統(tǒng)稱為血液制品例如：人血白蛋白、人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白等4.重組DNA制品采用遺傳修飾，將所需的編碼DNA通過一種質(zhì)粒或病毒載體，引入適宜的微生物或細(xì)胞系，DNA經(jīng)過表達(dá)翻譯后成為蛋白質(zhì)，再經(jīng)提取和純化而回收所需制品制得。宿主細(xì)胞：轉(zhuǎn)染載體前的細(xì)胞和微生物宿主-載體系統(tǒng)：用于生產(chǎn)過程中兩者穩(wěn)定的結(jié)合細(xì)胞因子類：重組人干擾素等生長因子類：重組人表皮生長因子激素類：重組人生長激素，重組人胰島素酶類：重組鏈激酶疫苗：重組乙型肝炎疫苗單克隆抗體：注射用人T細(xì)胞CD3鼠單抗5.診斷制品用于檢測(cè)相應(yīng)的抗原、抗體或機(jī)體免疫狀態(tài)的制品如：毒素、診斷血清、分群血清、分型血清等體外診斷制品：由特定抗原抗體或有關(guān)生物物質(zhì)制成的免疫診斷試劑或診斷試劑盒。如：傷寒、副傷寒診斷菌液，沙門氏菌診斷血清，HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒等體內(nèi)診斷制品：由變態(tài)反應(yīng)原或抗原材料制成的免疫診斷試劑如：卡介菌純蛋白衍生物等6.其他制品由有關(guān)生物材料或特定方法制成，不屬于以上5類的其他生物制劑，用于治療和預(yù)防疾病例如：胰島素、胃蛋白酶、核酸制劑等

三、特點(diǎn)

1.生物體的基本生化成分

2.分子量大:分子量測(cè)定

3.結(jié)構(gòu)難確證

4.全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、

最終產(chǎn)品

5.生物活性檢查

6.安全性檢查

7.效價(jià)（含量）測(cè)定：

理化法：有效成分的含量

效價(jià)測(cè)定和酶活力測(cè)定：有效成分的生物活性四、生物制品的全程質(zhì)量控制有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證有效成分的均一性、純度檢驗(yàn)有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)等的控制高效靈敏的生物活性及比活性等試驗(yàn)方法

生化藥物和基因藥物質(zhì)量控制的項(xiàng)目：

來源與種類純度

性狀干燥失重或水分

鑒別熾灼殘?jiān)?/p>

氨酸組分分析生物活性

肽圖熱源試驗(yàn)

糖含量含量分析

質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法

第二節(jié)鑒別試驗(yàn)

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

生物鑒別法：血清學(xué)法

生物學(xué)法一、理化鑒別法1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶-COiNH-+Cu2+絡(luò)合顯色

2.紫外分光光度法

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml判斷：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。

二、生化鑒別法1.酶法：例：尿激酶的鑒別---氣泡上升法原理：

方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時(shí)，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。2.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置相應(yīng)。三、生物鑒別法1.血清學(xué)法體外的抗原抗體試驗(yàn)。經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)免疫擴(kuò)散、免疫電泳以及熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高敏感的檢測(cè)技術(shù)例如:破傷風(fēng)抗毒素的鑒別人血白蛋白的鑒別重組人白介素-2的鑒別：免疫印記法、免疫斑點(diǎn)法

2.生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析

生產(chǎn)和貯存過程中雜質(zhì)的檢查安全性檢查

第三節(jié)雜質(zhì)檢查

生物污染：微生物污染、細(xì)胞成分、培養(yǎng)基成分產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)二聚體、多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、錯(cuò)誤裂解產(chǎn)物、二硫化物異構(gòu)體等工藝添加劑殘余抗生素、乙醇、佐劑氫氧化鋁等一、特殊雜質(zhì)的檢查㈠宿主細(xì)胞（菌）蛋白殘留量的檢查與生物制品生產(chǎn)用的細(xì)胞、工程菌相關(guān)的特殊雜質(zhì)控制異源蛋白的含量以防超量后引起機(jī)體的免疫反應(yīng)特別對(duì)于臨床使用中反復(fù)多次注射的藥品酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）原理試驗(yàn)方法㈡外源性DNA殘留量的檢查分子雜交技術(shù)基于DNA結(jié)合蛋白（threshold）分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)的方法1.分子雜交技術(shù)基于DNA探針檢測(cè)變性而且固定在硝酸纖維素膜上的宿主細(xì)胞DNA。雜交標(biāo)記探針-地高辛靈敏度是10pg以下2.基于DNA結(jié)合蛋白（threshold）分析系統(tǒng)基于兩種DNA序列非特異性蛋白-----單鏈DNA結(jié)合蛋白和抗ssDNA的單抗過程生物素-DNA單鏈結(jié)合蛋白和尿素酶-抗ssDNA的單抗與變性的宿主細(xì)胞DNA結(jié)合，形成復(fù)合物；通過親和素將這種復(fù)合物連接到生物素-硝酸纖維素膜；通過洗滌去除未結(jié)合的非特異性蛋白；最后將生物素-醋酸纖維素膜置于有尿素溶液的讀數(shù)儀，尿素酶催化尿素為NH3和CO2導(dǎo)致溶液的PH的變化，讀數(shù)儀根據(jù)此變化推算出外源性DNA的濃度3.實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)的方法基于PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過熒光信號(hào)指示，通過實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中的初始模板進(jìn)行定量分析。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線然后推測(cè)濃度㈢產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的檢查生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存的過程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體和降解產(chǎn)物等。方法有高效液相色譜法和電泳法㈣殘余抗生素的檢查中國藥典（2005年版）三部附錄ⅨA抗生素殘留量檢查法可以檢測(cè)殘余氨芐西林或四環(huán)素的活性依據(jù)在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較對(duì)照品與供試品對(duì)接種的試驗(yàn)產(chǎn)生的抑菌圈的大小，檢查供試品中氨芐西林或四環(huán)素的殘留量檢查方法結(jié)果判定注意事項(xiàng)二、安全性檢查㈠無菌檢查1.基本步驟：培養(yǎng)基的制備菌種的選擇具體檢查結(jié)果判斷2.注意事項(xiàng)㈡熱源檢查1.原理2.檢查法3.結(jié)果判斷㈢細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查凝膠法和光度法，當(dāng)出現(xiàn)爭(zhēng)議時(shí)，以凝膠法為準(zhǔn)㈣異常毒性的檢查和特異性毒性檢查1.異常毒性檢查生物制品的非特異性毒性的通用安全試驗(yàn)，檢查制品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素試驗(yàn)包括小鼠試驗(yàn)和豚鼠試驗(yàn)藥典中規(guī)定的異常毒性試驗(yàn)，實(shí)際上是一種限度試驗(yàn)2.特異性毒性檢查主要檢查某些疫苗類生物制品是否存在自身毒素引起的特異性毒性的不安全因素一般選擇小鼠或豚鼠試驗(yàn)㈤過敏反應(yīng)檢查將一定量的供試品溶液諸如豚鼠腹腔或皮內(nèi)，間隔一定的時(shí)間后靜脈或皮內(nèi)注射供試品進(jìn)行攻擊，觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)過敏反應(yīng)的情況，以判斷供試品是否引起動(dòng)物全身的過敏反應(yīng)過敏反應(yīng)是檢查異性蛋白的試驗(yàn)方法例子生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價(jià)或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

第四節(jié)含量（效價(jià)）測(cè)定含量測(cè)定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測(cè)定法、滴定分析法

電化學(xué)分析法

光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法

色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色譜法、HPCE法

酶法：酶活力測(cè)定法、酶分析法

電泳法

生物檢定法一、理化分析法㈠滴定法根據(jù)生物制品中某些成分能與標(biāo)準(zhǔn)溶液定量的發(fā)生酸堿中和反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等特性，通過滴定過程而進(jìn)行生物制品的含量測(cè)定的方法例如：胰酶中胰淀粉酶的測(cè)定㈡光譜法生物制品或相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)物的紫外光譜在某一特征波長處有最大吸收，且一定的濃度范圍內(nèi)與相應(yīng)的吸光度成正比，則可用于生物制品的含量測(cè)定例如：比色法測(cè)定硫酸軟骨素的含量㈢高效液相色譜法具有高效分析、靈敏檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)分離過程中不破壞分離樣品的特點(diǎn)適合于對(duì)高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的生物制品的定量分析1）RP-HPLC：柱前衍生化自動(dòng)測(cè)定氨基酸

柱：RP—18，柱溫：48℃

流動(dòng)相：A--0.05%TFA；B--乙腈-異丙醇（4：1）

梯度洗脫

熒光檢測(cè)器：

ex=280nm～340nm,em=430nm

測(cè)定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

樣品干燥：真空

樣品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/LNaOH

進(jìn)樣測(cè)定2.離子對(duì)色譜法一些生物制品如蛋白質(zhì)制品在水體系中可解離為帶電荷的離子，若向其中加入相反電荷的離子，使其形成中性離子對(duì)，會(huì)增大在非極性固定相中的溶解度，從而增加非配系數(shù)，改善分離效能分離正電荷生物制品的離子對(duì)試劑：烷基磺酸鹽分離負(fù)電荷生物制品的：四丁基季銨鹽色譜柱：十八烷基硅烷鍵和硅膠3.分子排阻色譜法快速分離不同分子量混合物的色譜法廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)等生物制品的分離分析及其分子量的測(cè)定固定相：親水性有機(jī)凝膠、硅膠或改性硅膠流動(dòng)相是可以溶解樣品的低粘度或有機(jī)溶劑---緩沖液混合溶液等特點(diǎn)1.生物活性蛋白質(zhì)可以回收制備2.色譜分離是在固定比例的水溶液體系中進(jìn)行3.色譜分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的4.分子排阻色譜法峰容量有限，在整個(gè)色譜圖中只能容納10-12個(gè)色譜峰，分離度低，不適合分離生物大分子二、生化分析法㈠電泳法帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，在電場(chǎng)的作用下，帶電粒子按各自的速度向極性相反的電極方向進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶