第五章生物技術(shù)

第五章單倍體細(xì)胞培養(yǎng)第五章第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)第四節(jié)植物單倍體育種本章主要內(nèi)容第四章本章教學(xué)目的與要求概念：花粉培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)，花粉二型性單倍體的應(yīng)用價(jià)值離體花粉的發(fā)育途徑花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較影響花藥培養(yǎng)的因素第四章第一節(jié)單倍體及其應(yīng)用價(jià)值一、概念二、單倍體的起源三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值第五章一、概念單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體或組織，體細(xì)胞染色體數(shù)為n單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要包括三個(gè)方面：花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未受精子房及卵細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)二、單倍體的起源①種間和屬間雜交

遠(yuǎn)緣雜交中，異種植物雖然不能與母本授粉、受精，由于遠(yuǎn)緣花粉的誘導(dǎo)作用，卵細(xì)胞在沒有受精的情況下受刺激而發(fā)育成胚土豆、大麥、小麥、玉米②物理照射和化學(xué)誘變

花粉用射線照射后失去了受精能力，然后與母株授粉，卵細(xì)胞在花粉的刺激作用下進(jìn)行孤雌發(fā)育，從而產(chǎn)生單倍體煙草、小麥、金魚草第一節(jié)③雙生苗的篩選（selectionoftwins）有些植物可產(chǎn)生多胚種子，即兩個(gè)或多個(gè)胚被共同的種皮包裹著，這些種子可產(chǎn)生單倍體-單倍體、二倍體-二倍體和單倍體-二倍體植株在辣椒中，雙生苗的頻率受母本基因型控制通過篩選可以提高雙生苗的頻率④花藥和花粉培養(yǎng)

第一節(jié)三、單倍體植物的特點(diǎn)及遺傳行為1、單倍體分成兩類:一倍單倍體（monohaploids），這類單倍體起源于二倍體物種多倍單倍體（polyhaploids），這類單倍體起源于多倍體（如4X，6X等）第一節(jié)diploid植物其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

水稻2n=2x=24n=x=12

柑橘2n=2x=18n=x=9

tetraploid植物其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24

陸地棉2n=4x=52n=2x=26

hexaploid植物其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21

octoploid植物其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28第一節(jié)2、單倍體植物的特點(diǎn)體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代第一節(jié)3、單倍體的遺傳行為一倍的單倍體只有一個(gè)染色體基數(shù)（X），減數(shù)分裂時(shí)染色體不能配對，分離極不正常但具有一定同源關(guān)系的染色體可以部分配對，從而可以對染色體的演化過程進(jìn)行研究四、單倍體的應(yīng)用價(jià)值母本×父本F1F2花藥培養(yǎng)花粉植株加倍選擇鑒定品系比較試驗(yàn)區(qū)域試驗(yàn)品種5—8代（一）、縮短育種周期第一節(jié)（二）、提高目標(biāo)基因型的選擇效率如果某一性狀受一對基因控制AA×aa→F1→F2中純合AA個(gè)體只有1/4F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍如屬兩對基因控制AAbb×aaBB,F2中要選出AABB個(gè)體的機(jī)率只有1/16F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，AaBb只產(chǎn)生4種花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB個(gè)體的頻率可達(dá)1/4比常規(guī)雜交育種效率提高4倍常規(guī)育種：單倍體育種=1/22n：1/2n。第一節(jié)（三）、排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾

對于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個(gè)體的選擇會造成一定誤差采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異第一節(jié)（四）、遺傳研究的良好實(shí)驗(yàn)材料體系

單倍體在作物的數(shù)量遺傳研究中可能有較大用途，如：基因相互作用的檢測、遺傳變異的估計(jì)、連鎖群的檢測、影響數(shù)量性狀的基因數(shù)目的估計(jì)及多基因的定位等

DH系是分子標(biāo)記遺傳作圖的良好群體單倍體可用來創(chuàng)造非整倍體材料，用單倍體與二倍體雜交，可創(chuàng)造一系列的附加系，從而研究染色體的遺傳功能花藥和花粉培養(yǎng)體系還是發(fā)育遺傳研究的良好材料，可以用來研究細(xì)胞的分裂及分化，研究花粉發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，以及與轉(zhuǎn)變有關(guān)的基因的表達(dá)與調(diào)控第一節(jié)（五）、突變體的篩選單倍體的每個(gè)基因都是單拷貝的，各種隱性基因都可以表現(xiàn)出來，加倍后形成的雙單倍體各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率對花藥進(jìn)行離子照射，然后對花藥愈傷篩選，可以獲得理想的突變體第一節(jié)（六）、消除致死基因單倍體帶有致死基因的個(gè)體即使加倍后形成雙單倍體也會由于基因的純合而被消除而致死基因在自然群體里常常因?yàn)殡s合體的存在而不易被徹底消除。（七）、選育新型自交系對雙親或多親雜交的雜種一代進(jìn)行花藥或花粉培養(yǎng)，獲得的雙單倍體實(shí)際上是純合的自交系，在雜種優(yōu)勢利用育種中有很大用途第一節(jié)（八）、遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料在轉(zhuǎn)基因育種中，如果用體細(xì)胞為受體，經(jīng)常遇到轉(zhuǎn)基因后代材料分離問題，經(jīng)多代選擇才能穩(wěn)定下來如用單倍體細(xì)胞作受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后，從理論上講會很快達(dá)到純合狀態(tài)受體材料可以是花粉、單倍體原生質(zhì)體、單倍體胚或單倍體植株作外植體第一節(jié)本節(jié)完第二節(jié)離體花粉/小孢子發(fā)育途徑一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)一、花粉/小孢子的正常發(fā)育階段（一）、花粉不均等分裂途徑(A途徑

)小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞。（1）A-V途徑（營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑）由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（2）A-G途徑（生殖細(xì)胞發(fā)育途徑）由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體（3）E途徑(營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑）由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株二、離體小孢子的發(fā)育途徑第二節(jié)第二節(jié)（二）花粉均等分裂途徑（B途徑）小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞繼續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株1、雄核發(fā)育與P花粉的形成花粉的二型性：在花藥/花粉培養(yǎng)時(shí)，由于對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，花粉在形態(tài)上形成兩種類型，一類是具胚性的，在煙草和大麥中，花粉小，染色淺；另一類為花粉大，染色深，朝成熟花粉方向發(fā)展P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理第二節(jié)在煙草和大麥中，花粉小，染色淺，為胚性的胚性小孢子第三節(jié)水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（約10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三節(jié)2、逆境處理與雄核發(fā)育的誘導(dǎo)

熱激處理物理或化學(xué)處理低溫處理營養(yǎng)饑餓處理重金屬脅迫激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚促使細(xì)胞同步分裂改變細(xì)胞分裂周期第二節(jié)本節(jié)完第三節(jié)花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍四、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的比較五、影響花藥培養(yǎng)的因素六、禾本科植物花藥培養(yǎng)中的白化苗現(xiàn)象第三節(jié)花藥培養(yǎng):是植物雄性生殖器官-花藥為外植體離體培養(yǎng)技術(shù)，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離出來，再加以離體培養(yǎng)。也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)一、花藥培養(yǎng)操作技術(shù)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第三節(jié)二、花粉培養(yǎng)操作技術(shù)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機(jī)械游離（1）磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法：通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子第三節(jié)(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第三節(jié)看護(hù)培養(yǎng)：第三節(jié)（一）花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式1、器官發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）-----繼代培養(yǎng)-----單倍體植株。2、胚狀體發(fā)生型花粉-----多細(xì)胞花粉粒----進(jìn)一步培養(yǎng)----胚壯體-----釋放-----植物體。第三節(jié)三、單倍體植株再生、鑒定及加倍第三節(jié)（二）、單倍體植株鑒定1、染色體直接計(jì)數(shù)法：通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2、間接鑒定（1）流式細(xì)胞儀鑒定：主要測定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法：葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。第三節(jié)（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法：單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。（4）雜交鑒定法：自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。（5）分子標(biāo)記鑒定 如RFLP、RAPD、AFLP等第三節(jié)（三）、染色體加倍1.莖段培養(yǎng)：將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由