第四章 基因操作中大分子物質(zhì)分離與分析

第四章基因操作中大分子的分離與分析目錄1、核酸的提取純化、檢測(cè)與保存2、核酸的凝膠電泳3、核酸的分子雜交4、外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法第一節(jié)

核酸的提取純化、檢測(cè)與保存DNA的類型（來(lái)源）1、染色體DNA2、病毒和噬菌體DNA3、質(zhì)粒DNA4、線粒體和葉綠體DNA第一部分DNA提取總論一、提取DNA總的原則：

1保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。二、樣本來(lái)源：理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康娜腔蚪M提取最常見(jiàn)的樣本三、DNA提取的基本步驟1、核酸的釋放：

破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母

Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞

Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母破裂細(xì)胞、釋放核酸2、核酸的分離與純化：

在含有核酸分子的復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離：

非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌4、DNA鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定濃度鑒定1）紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）各種堿基的紫外吸收光譜2）熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）EB與DNA的結(jié)合500

l全血提取的基因組DNA電泳動(dòng)物組織提取基因組DNA純度鑒定紫外分光光度法：在260nm和280nm處測(cè)定DAN溶液的光吸收，純的DNA，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有RNA的殘留量。

A260與A280之比應(yīng)在1.80；純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0。

A260/A280比值是純度檢測(cè)的重要指標(biāo)。1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0核酸的濃度與純度完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜拖尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測(cè)各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。DNA片段的降解完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強(qiáng)度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度積分低。

一般而言，28S（23S）RNA的熒光強(qiáng)度約為18S（16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，則說(shuō)明存在DNA的污染。

正常時(shí)，28SRNA的熒光強(qiáng)度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解5、核酸的貯存——DNA保存

1）短期貯存：

4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時(shí)DNA容易變性。2）長(zhǎng)期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。第二部分基因組DNA的分離與純化一、DNA樣品準(zhǔn)備

常見(jiàn)的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮二、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ合扔肊DTA、SDS、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。DNA酚抽提法示意圖主要試劑的作用：

EDTA：1二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)3對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用4與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用苯酚的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過(guò)多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會(huì)破壞DNA為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？

苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。PH8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。DNA的沉淀1）無(wú)水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無(wú)水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)DNA的損傷。2）異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子（二）甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。（三）玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kbDNA玻棒纏繞法示意圖（四）表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。二、DNA的濃縮

1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積三、DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段回收原則：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

DNA的檢測(cè)溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測(cè)，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。DNA提取試驗(yàn)中常遇到的問(wèn)題基因組DNA收率較低或無(wú)基因組DNA

樣本材料太少細(xì)胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分離不完全……DNA降解的原因樣本不夠新鮮，采集材料過(guò)陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因提取的基因組DNA鹽濃度過(guò)高基因組DNA中乙醇未清除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時(shí)加入蔗糖的原因加入多糖，保護(hù)DNA長(zhǎng)度質(zhì)粒DNA制備

plasmidextraction

質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒.

這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA質(zhì)粒質(zhì)粒特性

1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性(incompatibility)4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記(selectivemarkers)6.限制性內(nèi)切酶單一切口

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化

質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacterialculture)1、先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。

三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

質(zhì)粒提取的方法堿裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法其他質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

l

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題。l選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：

1．菌株類型（type）

2．質(zhì)粒的大小(size)3．細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制

(denaturationcondition)質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：

采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（<15kb）的處理方法：

無(wú)需特殊處理，堿裂解方法等均可使用四、細(xì)菌的裂解和質(zhì)粒DNA的提取

(bacterialandplasmidextraction)在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋