第四章 基因操作中

第四章基因操作中大分子的分離和分析圖4-1黨參樣品基因組DNA電泳圖譜圖4-2小麥DNA電泳圖譜

圖4-3異硫氰酸胍法提取蕓芥柱頭總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

28S18S第三節(jié)分子雜交主講內(nèi)容SouthernblottingNorthernblottingWesternblottingDotblottinginsituhybridization【基本原理】把不同生物個體來源的、親源關(guān)系較近的具有一定同源性的兩條單鏈核酸（DNA或RNA)混合在一起，在適宜的溫度及離子強度等條件下，其相應(yīng)同源區(qū)段會按照堿基互補配對原則特異地退火形成雜合雙鏈。當(dāng)用一個標(biāo)記的已知核酸片段與待測的核酸樣品雜交時，可檢測出該樣品中是否存在與探針具有同源性的核酸分子，并推測其相對分子質(zhì)量的大小。如：采用現(xiàn)成可用的DNA探針或RNA探針，便可以檢測出克隆子中是否含有目的基因。復(fù)性RNADNA【應(yīng)用范圍】分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法。(1)可以檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子存在與否，以及其相對分子質(zhì)量大小及表達豐度?！炯夹g(shù)流程】第一，核酸印跡轉(zhuǎn)移將待測核酸樣品經(jīng)變性處理，用一定的方法轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上?！菊f明】電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。【說明】尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜。第二，分子雜交將帶有核酸印跡的濾膜同經(jīng)標(biāo)記示蹤的特異核酸探針雜交結(jié)合，洗去其它非特異結(jié)合的核酸分子，示蹤標(biāo)記將指示待測核酸中能與探針互補的特異DNA片段所在的位置。一、Southern印跡雜交

【說明】被檢測對象為DNA。

1、原理根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與被標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用，檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片度。DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的濾膜帶有DNA片段的凝膠2、Southern印跡雜交的技術(shù)流程白瓷盤玻璃板尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜凝膠濾紙tissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無水乙醇離心PaperTowelsSouthern印跡雜交的主要步驟①將DNA樣品用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；②經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過電轉(zhuǎn)移將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定（凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著）。③附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影技術(shù)確定在眾多酶解產(chǎn)物中與探針互補的每條DNA帶的位置和大小。3、有關(guān)新的轉(zhuǎn)移方法

傳統(tǒng)的Southern印跡轉(zhuǎn)移（如毛細管虹吸印跡法）效率不高，尤其是對于大分子的DNA片段。進年來，發(fā)展出了一些新的轉(zhuǎn)移方法。真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙凝膠蓋子+-真空轉(zhuǎn)膜擴散法和毛細管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低（擴散法為70%，毛細管法80%），耗時多。電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴。真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。

4、Southern印跡雜交技術(shù)的優(yōu)點

該雜交方法十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每道電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。

5、Southern印跡雜交技術(shù)的用途可用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（應(yīng)用范圍）

是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測，在遺傳診斷中DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面亦有重要應(yīng)用價值。（實際應(yīng)用價值）二、Northern印跡雜交1、Northern印跡雜交的技術(shù)流程與Southern印跡雜交的基本類似，但除以下幾點之外：①靶核酸：RNA，不需用限制酶消化②RNA電泳：變性電泳③轉(zhuǎn)膜：RNA分子不需采用堿變性處理。④在與探針雜交之前，將真空干燥后的固相膜轉(zhuǎn)至Tris-HCl緩沖液中，95℃放置5-10min，洗脫與RNA結(jié)合的甲醛或乙二醛，以提高雜交靈敏度。2、RNA變性凝膠電泳①常用的變性劑

甲醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素、甲酰胺。②甲醛變性凝膠電泳原理

防止堿基間的配對與防止酶對RNA的降解作用。③RNA變性凝膠電泳一般要求較低電壓

以3-4v/cm為宜④RNA變性凝膠電泳過程中要注意檢測電極液的pH值。

當(dāng)pH值>8.0時，會引起甲醛-RNA復(fù)和物解離。3、應(yīng)用檢測細胞或組織樣品中是否存在與探針同源的mRNA分子，從而判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達，在有合適對照的情況下，通過雜交信號的強弱還可以比較基因表達的強弱。三、Western印跡雜交1、原理將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上以固定，再用標(biāo)記的特異蛋白質(zhì)（抗體）進行“抗體-抗原”免疫反應(yīng)以鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。【說明】Western印跡雜交的總體過程與Southern印跡雜交的類似。2、用途主要用來檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在與否。細胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析。研究蛋白質(zhì)分子之