第十一章熒光分析法

第十章熒光分析法分子熒光、磷光分析法的基本原理

介紹熒光磷光光譜的產(chǎn)生、主要影響因素、熒光強(qiáng)度與被測(cè)物質(zhì)之間的關(guān)系熒光分析儀器分子熒光定量分析簡(jiǎn)介化學(xué)發(fā)光第一節(jié)熒光分析的基本原理一、分子發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來(lái)激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來(lái)激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法二、分子熒光分析法的特點(diǎn)1.靈敏度高熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度

采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)激發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)強(qiáng)激發(fā)光物質(zhì)2.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長(zhǎng)不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測(cè)熒光波長(zhǎng)比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單4.待測(cè)樣品用量少；儀器價(jià)格適中；測(cè)定范圍較廣具發(fā)光強(qiáng)度可定量測(cè)定許多痕量的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，不如分光光度法熒光和磷光光譜法一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光基態(tài)分子價(jià)電子躍遷到激發(fā)態(tài)光照激發(fā)去激發(fā)光*

*n基態(tài)在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過(guò)程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來(lái)描述1.電子自旋狀態(tài)的多重性大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，基態(tài)分子每一個(gè)軌道中兩個(gè)電子自旋方向總是相反的

，處于基態(tài)單重態(tài)。用“S0”表示；當(dāng)物質(zhì)受光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒(méi)有改變，凈自旋=0.這種躍遷是符合光譜選律的基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8若分子中電子躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的改變，由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷

T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)三重態(tài)T1自旋平行三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4~1S分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時(shí)有兩種方式：無(wú)輻射去激和輻射去激2.無(wú)輻射去激——不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過(guò)程叫無(wú)輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放。包括：內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC）—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S系間竄躍（ISC）—不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T振動(dòng)馳豫（VR）—同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程外部轉(zhuǎn)移—指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消滅發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1—T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍3.熒光和磷光光譜的產(chǎn)生—輻射去激處于S1或T1態(tài)的電子返回S0態(tài)時(shí)，伴隨有發(fā)光現(xiàn)象，這種過(guò)程叫輻射去激S1或T1S0

發(fā)光（1）熒光：當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)S0各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光輻射叫熒光熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅無(wú)論開(kāi)始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過(guò)無(wú)輻射去激消耗能量后到S1的最低振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射熒光，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。

熒>

激T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖分子熒光光譜產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍（2）磷光當(dāng)受激電子降到S1的最低振動(dòng)能級(jí)后，未發(fā)射熒光，而是經(jīng)過(guò)系間竄躍到T1振動(dòng)能級(jí)，經(jīng)振動(dòng)馳豫到T1最低振動(dòng)能級(jí)，從T1最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所發(fā)射的光叫磷光從T1

S1要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間分子相互碰撞的無(wú)輻射能量塤耗大，所以磷光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)

磷>

熒>

激

*易產(chǎn)生熒光n*易產(chǎn)生磷光T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光

磷光圖分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系了解熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以預(yù)測(cè)哪些物質(zhì)能產(chǎn)生熒光，在什么條件下產(chǎn)生，以及發(fā)射的熒光有什么特征以便更好地運(yùn)用熒光分析技術(shù)，采取一些措施把不發(fā)熒光的物質(zhì)產(chǎn)生熒光，即把非熒光體變成熒光體，弱熒光體變成強(qiáng)熒光體（一）熒光效率熒光強(qiáng)度常用熒光量子效率φf(shuō)來(lái)描述

熒光量子效率

f=發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)

f是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間若以各種躍遷速率常數(shù)來(lái)表示Kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)——取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)∑Ki為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和——主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)分析上有應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物的熒光效率在0.1~1之間至今對(duì)激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解不深，無(wú)法定量地描述熒光與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系一般情況，有機(jī)芳香族化合物及金屬離子配合物是最強(qiáng)最有用的熒光體（二）熒光磷光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系物質(zhì)只有吸收了紫外可見(jiàn)光，產(chǎn)生*n*躍遷，產(chǎn)生熒光*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103，壽命短*躍遷常產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光1.共軛體系——有較強(qiáng)的熒光具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長(zhǎng)越長(zhǎng)，發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)

f

ex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定

3，4-苯并芘是強(qiáng)致癌物

ex=386nm

em=430nm2.剛性平面結(jié)構(gòu)—較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無(wú)氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體（三）金屬螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定不少有機(jī)配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會(huì)使熒光加強(qiáng)或產(chǎn)生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)（四）取代基的類型——取代基對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。分成三類：（1）增強(qiáng)熒光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（2）減弱熒光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。（3）影響不明顯的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等三、環(huán)境對(duì)熒光、磷光的影響1.溶劑的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)一般來(lái)說(shuō)，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大

2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大3.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長(zhǎng)例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無(wú)熒光但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無(wú)熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無(wú)熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性一、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系第二節(jié)熒光定量分析方法用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系If=

fIa=

f（I0-I）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=

f（I0-I010-A）=

fI0

（1-10-A）I=I010-A將上式展開(kāi)當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化

If=2.3

fI0A=2.3

fI0

bc當(dāng)A﹤0.05時(shí)，If與

f、I0、

和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、

和b為常數(shù)，合并為K

If=KC

定量分析依據(jù)熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低因?yàn)楣絒]中后面影響，有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)熒光猝滅——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率

f下降稱為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見(jiàn)的熒光猝滅劑碰撞猝滅——M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光被熒光物質(zhì)的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示器組成光源第一單色器液池檢測(cè)器第二單色器檢測(cè)器放大器及記錄器ex

em與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角I0I第三節(jié)熒光和磷光分析儀器1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光計(jì)中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源2、單色器熒光計(jì)用濾光片作單色器，熒光計(jì)只能用于定量分析，不能獲得光譜大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)

ex，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)

ex第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)

em。在選定的em下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析3、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（二）激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長(zhǎng)下，測(cè)量熒光體的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化的光譜I

ex固定

em熒光波長(zhǎng)獲得方法：先把第二單色器的波長(zhǎng)固定，使測(cè)定的

em不變，改變第一單色器波長(zhǎng)，從200~700nm掃描，讓不同波長(zhǎng)的光照在熒光物質(zhì)上，測(cè)定它的熒光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜從曲線上找出ex，實(shí)際上選波長(zhǎng)較長(zhǎng)的高波長(zhǎng)峰I

em固定

ex激發(fā)光波長(zhǎng)獲得方法：先把第一單色器的波長(zhǎng)固定，使激發(fā)的

ex不變，改變第二單色器波長(zhǎng)，讓不同波長(zhǎng)的光掃描，測(cè)定它的發(fā)光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的em從圖中看出

磷＞熒＞

激圖吸收峰熒光峰磷光峰（三）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測(cè)定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。二、

熒光、磷光分析及應(yīng)用（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定它們的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。以相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)濃度C1C2C3C4C5Cx熒光強(qiáng)度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC2.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性若熒光物質(zhì)M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQM+Q=MQ（非熒光物質(zhì)）經(jīng)推導(dǎo)得出：猝滅劑加入前的熒光強(qiáng)度猝滅劑加入后試液的熒光強(qiáng)度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C（Q）有線性關(guān)系，可求猝滅劑含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，對(duì)一定濃度的熒光體系，分別加入一系列不同量的猝滅劑Q，配成一個(gè)熒光物質(zhì)—猝滅劑體系，然后在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度，得一曲線取相同熒光物質(zhì)CMCMCMCM

…

CM加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

測(cè)IfI前I后1I后2I后3

…I后

x計(jì)算I前/I后I前/I后1

I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

I前/I后xCQxCQI前/I后3.比較法——比較簡(jiǎn)單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測(cè)量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度未知液If

x=KCx標(biāo)準(zhǔn)液If

s=KCs

比較4.多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測(cè)定可分別在各自的

熒波長(zhǎng)處測(cè)定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定Al3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激發(fā)光，Al3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Ga3+配合物不產(chǎn)生熒光，無(wú)熒光峰；436nm激發(fā)光，Ga3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Al3+配合物不產(chǎn)生熒光，無(wú)熒光峰在365nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Al3+—8-羥基喹啉配合物，在436nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Ga3+—8-羥基喹啉配合物例：(3)如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強(qiáng)度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在適宜的熒光波長(zhǎng)處測(cè)定，用聯(lián)立方程來(lái)求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nm

em=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫