免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握凝集反應(yīng)的原理2.直接凝集反應(yīng)3．間接凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.直接凝集反應(yīng)2．間接凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)顆粒性抗原與其相應(yīng)的抗體特異結(jié)合時(shí)，在電解質(zhì)存在下，兩者比例合適時(shí)，可出現(xiàn)凝集顆粒，此現(xiàn)象稱凝集反應(yīng)。一、直接凝集反應(yīng)一血型鑒定人類血型是以紅細(xì)胞表面所帶抗原的不同而命名。紅細(xì)胞表面主要帶A、B兩種抗原，人類血清中主要含有兩種抗體（抗A或抗B抗體），用抗A或抗B標(biāo)準(zhǔn)血清可以鑒定四種不同的血型，既A、B、AB、O表型。現(xiàn)介紹玻片直接凝集法。（一）材料：人抗A和抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、生理鹽水、被檢者紅細(xì)胞、采血針、試管、載玻片、滴管、皮膚消毒劑。（二）方法1、用酒精棉球消毒指端皮膚，針刺受檢者指端取血一滴，加入盛有2ml生理鹽水的試管中，制成紅細(xì)胞懸液（約2%）。2、

取清潔載玻片，用記號(hào)筆劃分兩半，左角上注A字，右角上注B字。3、

于玻片A側(cè)中央加抗A型標(biāo)準(zhǔn)血清一滴，于玻片B側(cè)中央加抗B血清一滴。4、

用滴管取受檢者紅細(xì)胞懸液加入抗A血清及抗B血清中各一滴，搖動(dòng)玻片使紅細(xì)胞與血清充分混勻，15～20min后肉眼或低倍鏡觀察結(jié)果，以凝集現(xiàn)象的有無，按下表報(bào)告結(jié)果。血型凝集現(xiàn)象抗B標(biāo)準(zhǔn)血清抗A標(biāo)準(zhǔn)血清O－－A－＋B＋－AB＋＋

二、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原吸附在惰性顆粒載體上，與其相應(yīng)抗體可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。以乳膠吸附豬細(xì)小病毒作為抗原，豬細(xì)小病毒免疫血清作為抗體，兩者相遇，即出現(xiàn)凝集。（一）材料：作為抗體的豬細(xì)小病毒免疫血清、吸附豬細(xì)小病毒的乳膠、生理鹽水、載玻片等。（二）方法1、取潔凈載玻片，用記號(hào)筆分為兩格。2、用滴管取生理鹽水一滴加于玻片右端，再取豬細(xì)小病毒的乳膠一滴加于玻片左端。3、各加一滴作為抗體的豬細(xì)小病毒免疫血清，分別混勻。4、緩慢搖動(dòng)2～5min，并觀察結(jié)果。思考討論1、直接凝集反應(yīng)與間接凝集反應(yīng)的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)二免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握免疫沉淀反應(yīng)的原理2.瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)可溶性抗原與其相應(yīng)抗體相遇，在有電解質(zhì)存在的條件下，二者比例合適可出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀，故名沉淀反應(yīng)。。一、瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散在含有電解質(zhì)的瓊脂中，抗原抗體分子互相彌漫擴(kuò)散，當(dāng)比例合適時(shí)可出現(xiàn)沉淀帶。此法可用于分析抗原成分，以及鑒定抗體的純度等。（一）材料：1％生理鹽水瓊脂糖、人IgG、抗人IgG血清、載玻片、打孔器等。（二）方法1、將1％鹽水瓊脂糖加熱溶化。2、取一潔凈載玻片，放水平臺(tái)上，將已熔化的瓊脂3～4ml趁熱傾注在玻片上制成厚薄均勻的瓊脂糖凝膠板。3、待瓊脂凝固后，按圖2．1打孔。4、在中心孔內(nèi)加入抗人IgG血清。5、1孔加入空白對(duì)照。6、于2，3，4各孔中分別加入不同濃度的人IgG。7、將瓊脂糖凝膠板放濕盒中，置37℃溫箱中24h11324324圖2．1

實(shí)驗(yàn)三免疫酶技術(shù)ELISA實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握免疫酶技術(shù)ELISA的原理2.掌握免疫酶技術(shù)ELISA的技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：免疫酶技術(shù)ELISA免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechniques）是指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)（或生物）發(fā)光劑等作為示蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，可在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般免疫血清學(xué)方法。根據(jù)試驗(yàn)中所用標(biāo)記物的種類和檢測(cè)方法不同，免疫標(biāo)記技術(shù)分為免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定。在此基礎(chǔ)上發(fā)展了生物素-抗生素標(biāo)記技術(shù)。

一、免疫酶技術(shù)ELISA免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應(yīng)性，也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時(shí)，酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應(yīng)的抗原或抗體是否存在及其量的多少。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一類常用的免疫酶技術(shù)，可用于測(cè)定抗體，也可用于檢測(cè)抗原。該實(shí)驗(yàn)常用的酶為辣根過氧化物酶，底物為鄰苯二胺（OPD）。實(shí)驗(yàn)方法有間接法、雙抗體夾心法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。一)材料和試劑：已知人IgG含量的參考蛋白、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體、包被液：pH9.60.05mol/L碳酸鹽緩沖液、封閉液：10%脫脂奶粉溶液、稀釋液：含10%牛血清白蛋白pH7.40.01mol/LPBS、洗滌液：pH7.40.01mol/LPBS-吐溫20、底物溶液：OPD-H2O2、終止液：2mol/LH2SO4、96孔酶標(biāo)反應(yīng)板。二)操作步驟1、包被：將人IgG用包被液適當(dāng)稀釋至不同濃度，在96孔反應(yīng)板中每孔加100ml，每個(gè)濃度2孔，置370C2h2、

洗滌：將96孔反應(yīng)傾去包被液，用洗滌液PBS-吐溫20加滿各孔，置3min，傾去，如此反復(fù)3次。3、

封閉：每孔加200ul的封閉液封閉20-30min，4、洗滌3次（同上）5、

加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體（其稀釋度根據(jù)預(yù)試結(jié)果而定）每孔100ml，（PBS-T206、

370C孵育17、

洗滌3次（同上）。8、

顯色：加新鮮配制的底物溶液，每孔100ml，在室溫下避光放置15min9、

終止反應(yīng)：每孔加2mol/LH2S0450ml10、用肉眼觀察每孔顏色深淺或以酶標(biāo)光度計(jì)495nm濾光片測(cè)各孔OD值。三）結(jié)果觀察與分析空白對(duì)照及陰性對(duì)照應(yīng)無色。參考蛋白各孔呈棕黃色，并呈明顯的顏色深淺梯度。四）注意事項(xiàng)1、

在加已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體時(shí)，應(yīng)從低濃度的第一管開始加，避免將高濃度的抗體帶入低濃度的孔中引起誤差。2、

應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測(cè)得OD值不準(zhǔn)確。

思考討論：ELISA操作中的注意事項(xiàng)。什么是假陽性與假陰性？ELISA的假陽性與假陰性發(fā)生的原因有那些？

實(shí)驗(yàn)四小鼠脾細(xì)胞分離、形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握小鼠脾細(xì)胞分離技術(shù)2.觀察小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)并計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.小鼠脾細(xì)胞分離2．觀察小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)并計(jì)數(shù)材料和試劑：小鼠、帆布手套、酒精、無菌剪刀、鑷子及注射器活塞、一次性小號(hào)無菌培養(yǎng)皿、無菌1640液、紅細(xì)胞裂解液（無菌的8.3%氯化銨溶液，即100克蒸餾水中加8.3克氯化銨）、帶蓋的無菌離心管、計(jì)數(shù)板、顯微鏡、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)(帶紫外燈)、滅菌鍋、移液槍及無菌的槍頭。二)操作步驟1、小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3分鐘，取出小鼠置于無菌超凈臺(tái)上，左腹側(cè)朝上。2、在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟。3、在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結(jié)締組織，取出脾臟。放入盛有1640液的一次性小號(hào)無菌培養(yǎng)皿中。4、用鑷子將脾臟表面的粘液等洗去，然后用鑷子將脾臟轉(zhuǎn)移到另一盛有少量1640液的一次性小號(hào)無菌培養(yǎng)皿中，用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，盡量研碎后再加適量的1640液，并用鑷子去掉細(xì)胞懸液中的粗渣。5、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至帶蓋的無菌離心管中，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，去掉上清。6、向離心管中加適量的紅細(xì)胞裂解液（無菌的8.3%氯化銨溶液，即100克蒸餾水中加8.3克氯化銨），使細(xì)胞重懸后靜置5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，去掉上清。7、向離心管中加適量的1640液，使細(xì)胞重懸。8、用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。注：1.一般6-8周齡小鼠，根據(jù)品系不同，可得5-20×107細(xì)胞/只小鼠；2.手術(shù)器械滅菌：術(shù)前高壓滅菌外，也可將手術(shù)器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精燈上燒灼去除酒精，即可保證無菌，此法較為簡(jiǎn)便。思考討論1、如何保證分離小鼠脾細(xì)胞過程中無微生物污染？

實(shí)驗(yàn)五小鼠的注射方法及血液采集方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模壕毩?xí)對(duì)小鼠注射的操作方法與小鼠的采血方法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：小鼠注射的操作方法與小鼠的采血方法一、材料和試劑1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠2、溶液或試劑滅菌的生理鹽水（代替實(shí)驗(yàn)材料，用以注射）3、儀器或其它用具無菌注射器（1ml），剪刀，鑷子，碘酒棉花，75%的酒精棉花，消毒干棉花，無菌棉簽，無菌棉球，毛細(xì)吸管，橡皮吸管頭，無菌ＥＰ管，一次性手套若干，帆布手套若干。二、操作步驟一）小鼠注射：常用的注射途徑有皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔和靜脈等1、取出無菌注射器及針頭，吸入注射材料（本實(shí)驗(yàn)以生理鹽水代替），并排盡空氣（若材料具有傳染性，則排氣時(shí)以消毒棉花包住針頭，以免傳染材料外溢而污染環(huán)境）。2、皮下注射：將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)的過程。作皮下注射常選項(xiàng)背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時(shí)，戴上手套，用右手拖鼠尾，使其爬行于較粗糙的臺(tái)面或鐵絲試管架的底面，再用左手拇指和食指緊抓小鼠頸部?jī)啥g的皮膚，將手翻轉(zhuǎn)，使小鼠腹部向上，左手無名指和小指夾住鼠尾和后肢；先用碘酒棉花，后用75%的酒精棉花消毒小鼠腹部皮膚，右手持備好的注射器，針頭稍平刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地注射若干生理鹽水（注射快慢要適度，以免注射液溢出），注射量約為0.1～0.3ml。拔針時(shí)用無菌棉簽輕壓進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。針頭拔出后，皮下呈擴(kuò)散狀隆起者為注射正確。3、皮內(nèi)注射：將藥液注入皮膚的表皮河真皮之間，觀察皮膚血管的通透性變化或皮內(nèi)反應(yīng)，接種、過敏實(shí)驗(yàn)等一般作皮內(nèi)注射。操作時(shí)，戴上手套，1人固定小鼠，另1人先將注射部位的被毛剪掉，局部常規(guī)消毒，左手拇指和食指按住皮膚使之繃緊，在兩指之間，用注射器針頭穿刺，針頭進(jìn)入皮膚淺層，再向上挑起并梢刺入，將生理鹽水注入皮內(nèi)。注射后皮膚出現(xiàn)一白色小皮丘，而皮膚上的毛孔極為明顯。注射量為0.1ml/次。拔針時(shí)用無菌棉簽輕壓進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。4、肌肉注射：小鼠體積小，肌肉少，很少采用。當(dāng)給小鼠注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時(shí)，采用肌肉注射。操作時(shí)，戴上手套，1人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1條后肢，右手拿注射器。將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入生理鹽水，用量不超過0.1ml。拔針時(shí)用無菌棉簽輕輕按住進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。5、腹腔注射：戴上手套，抓取與固定小鼠同皮下注射。使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會(huì)自然倒向胸部，防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。右手持注射器，進(jìn)針的動(dòng)作要輕柔，防止刺傷腹部器官。尤其是對(duì)于體重較小的小鼠，腹腔注射時(shí)針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側(cè)進(jìn)針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射0.1ml生理鹽水，注射完后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。拔出針頭后，用無菌棉簽輕壓注射部位。6、靜脈注射：將小鼠放在金屬籠或鼠夾中，通過金屬籠或鼠夾的孔拉出尾巴（也可人工國定小鼠），戴上手套，用左手抓住小鼠尾巴中部。小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈，2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩惻的靜脈.拔去沿尾部靜脈走向的毛，置尾巴于45～50℃溫水中浸泡幾分鐘或用75%酒精棉球反復(fù)擦拭尾部，以達(dá)到消毒和使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的。行尾部靜脈注射時(shí)，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩惻，使靜脈更為充盈，用中指從下面托起尾巴，以無名指夾住尾巴的末梢,右手持注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/3處進(jìn)針，開始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入生理鹽水（正常情況下，推注的過程應(yīng)該沒有明顯阻力，血管也不會(huì)鼓起。推液時(shí)動(dòng)作宜輕柔，若發(fā)現(xiàn)血管鼓起，那是針頭沒有刺入血管，需立即拔出針頭。）。有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始（但是進(jìn)針部位也不可以太靠下，因?yàn)樵酵?，靜脈越細(xì)，操作越難，一般以小鼠尾巴下三分之一的位置比較好），按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射給藥。注射量為0.05～0.1ml/10g體重。拔出針頭后，用無菌棉簽二）小鼠采血：常用的采血方法有剪尾采血、靜脈采血、摘除眼球采血、心臟采血、頜下靜脈叢采血。1、剪尾采血：戴上手套，拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚，將小鼠頭朝下，小鼠固定后將其尾巴置于50°熱水中浸泡數(shù)分鐘，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用EP管接流出的血液，同時(shí)自尾根部向尾尖按摩。取血后用無菌棉球壓迫止血并用6%液體火棉膠涂在傷口處止血。每次采血量0.1ml。此方法無需麻醉、創(chuàng)傷小、可重復(fù)采血，是一種簡(jiǎn)便、安全、快速的采血方法。2、靜脈采血：戴上手套，固定小鼠,將采血注射針頭刺入頜下靜脈叢血管取血，每次采血量可達(dá)到0.3-0.5ml。此方法無需麻醉、創(chuàng)傷小、采血量大并可重復(fù)采血，是一種簡(jiǎn)便、安全、快速、采血量多的采血方法。3、摘除眼球采血：戴上手套，左手抓住小鼠頸部皮膚，輕壓在