流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊申報資料技術(shù)審評指導(dǎo)建議原則

流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊申報資料技術(shù)審評指導(dǎo)原則一、前言本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對流行性感冒病毒（下列簡稱流感病毒）核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。本指導(dǎo)原則是對流感病毒核酸檢測試劑的普通規(guī)定，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體特性擬定其中內(nèi)容與否合用，若不合用，需具體論述理由及對應(yīng)的科學(xué)根據(jù)，并根據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文獻(xiàn)，但不涉及注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足有關(guān)法規(guī)規(guī)定的其它辦法，也能夠采用，但需要提供具體的研究資料和驗(yàn)證資料，有關(guān)人員應(yīng)在遵照有關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和原則體系以及現(xiàn)在認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和原則的不停完善，以及科學(xué)技術(shù)的不停發(fā)展，本指導(dǎo)原則有關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)節(jié)。二、合用范疇流感病毒核酸檢測試劑是指運(yùn)用熒光探針PCR或其它類分子生物學(xué)辦法，以特定的流感病毒基因序列為檢測目的，對人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其它呼吸道分泌物樣本中的流感病毒進(jìn)行體外定性檢測的試劑。本指導(dǎo)原則合用于進(jìn)行初次注冊申報和有關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。三、注冊申報資料規(guī)定（一）綜述資料流感病毒涉及甲、乙、丙三型，甲型最容易引發(fā)流行，乙型次之，丙型極少引發(fā)流行。根據(jù)病毒顆粒外膜血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒現(xiàn)在可分為16個H亞型（H1-H16）和9個N亞型（N1-N9），現(xiàn)在已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亞型有人感染的報道。由于編碼HA和（或）NA的核苷酸序列容易發(fā)生突變，致使HA和（或）NA的抗原表位發(fā)生變化，這種抗原性的變化使人群原有的特異性免疫力失效，故甲型流感病毒常引發(fā)較大規(guī)模甚至世界性的流感流行。按照流行特點(diǎn)，造成人間流感流行的流感病毒可辨別為季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒。季節(jié)性流感病毒普通在年度間發(fā)生小范疇的基因變異，這種基因變異會造成微小的抗原性變化，稱為抗原漂移（antigenicdrift），因此，季節(jié)性流感病毒雖含有年度特異性且抗原性的變化使感染者不易獲得持久免疫力，但傳輸范疇普通局限于較小的人群范疇，普通不會造成太高的發(fā)病率和死亡率，易動人群多為老年人（>65歲）和嬰幼兒（<6歲）。在過去的幾十年中，季節(jié)性流感病毒重要集中在甲型H3N2和H1N1亞型。近年來，新型甲型流感病毒亞型暴發(fā)流行的案例時有發(fā)生。例如，新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亞型）病毒的病例時有報道，禽類甲型H5N1亞型流感病毒被認(rèn)為含有造成人間大范疇流感流行的潛力。新型甲型流感病毒普通由于基因的節(jié)段性重組所致，這種大范疇的基因變化易造成病毒抗原特性的重大變化，稱為抗原轉(zhuǎn)變（antigenicshift），新型甲型H1N1流感病毒（）即同時包含了禽流感、豬流感和人季節(jié)性流感的基因片段從而造成病毒在抗原水平發(fā)生了明顯變化。由于抗原性的明顯變化以及可能由此造成的病毒毒力的增強(qiáng)，病毒的傳染性和致病嚴(yán)重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的發(fā)病率和死亡率。流感病毒重要經(jīng)空氣飛沫傳輸，常引發(fā)發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛以及輕到中度的呼吸道癥狀，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸檢測試劑可用于流感的輔助診療，甲型流感病毒各亞型檢測試劑還可用于辨別季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可獲得有關(guān)流感暴發(fā)的流行病學(xué)信息。用于流感病毒檢測的樣本采集無法原則化，且含有一定的隨意性，運(yùn)用核酸定量檢測的辦法對流感病人進(jìn)行病情監(jiān)測或療效觀察，并無合理的臨床指導(dǎo)意義，甚至可能造成錯誤的醫(yī)學(xué)解釋，誤導(dǎo)用藥量的增減或其它診療方法，因此，不建議公司研發(fā)流感病毒核酸的定量檢測試劑。在注冊申報資料中，流感病毒的命名應(yīng)采用世界衛(wèi)生組織有關(guān)流感病毒毒株命名的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。流感病毒毒株命名涉及6個要素：型別/宿主/分離地區(qū)/毒株序號/分離年份（Hn和Nn），H和N分別代表血凝素和神經(jīng)氨酸酶，n是阿拉伯?dāng)?shù)字，對于人流感病毒能夠省略宿主信息。如名為“A/Shanghai/37T/（H1N1）”的病毒株代表在上海分離的以人為宿主的甲型H1N1亞型流感病毒，毒株序號為37T。綜述資料重要涉及產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的闡明、研究成果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市狀況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市狀況介紹部分應(yīng)著重從辦法學(xué)及不同類型毒株檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與現(xiàn)在市場上已獲同意的同類產(chǎn)品之間的重要區(qū)別。應(yīng)符合《體外診療試劑注冊管理方法（試行）》（下列簡稱《方法》）和《體外診療試劑注冊申報資料基本規(guī)定》（國食藥監(jiān)械[]609號）的有關(guān)規(guī)定。（二）產(chǎn)品闡明書闡明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及解決、實(shí)驗(yàn)辦法、檢測成果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員對的操作、臨床醫(yī)生針對檢查成果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要根據(jù)，因此，產(chǎn)品闡明書是體外診療試劑注冊申報最重要的文獻(xiàn)之一。產(chǎn)品闡明書的格式應(yīng)符合《體外診療試劑闡明書編寫指導(dǎo)原則》的規(guī)定，境外試劑的中文闡明書除格式規(guī)定外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文闡明書的一致性，翻譯力求精確且符合中文體現(xiàn)習(xí)慣。產(chǎn)品闡明書的全部內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的有關(guān)研究成果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的有關(guān)信息。結(jié)合《體外診療試劑闡明書編寫指導(dǎo)原則》的規(guī)定，下面對流感病毒核酸檢測試劑闡明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行具體闡明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完畢闡明書編制。1.【預(yù)期用途】應(yīng)最少涉及下列幾部分內(nèi)容：（1）試劑盒用于定性檢測人鼻咽拭子、口咽拭子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其它呼吸道分泌物樣本的流感病毒RNA，合用樣本類型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完畢狀況進(jìn)行確認(rèn)。（2）簡樸介紹待測目的的特性，如病毒種系淵源、生物學(xué)性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床體現(xiàn)、待測靶基因特性等。（3）待測人群特性介紹：含有流感樣癥狀的患者、有關(guān)的親密接觸者、地區(qū)規(guī)定或年紀(jì)限制（如有）等。（4）強(qiáng)調(diào)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)辦法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，含有有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)含有合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。2.【重要構(gòu)成成分】（1）闡明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其它特性；不同批號試劑盒中各組份與否能夠交換。（2）試劑盒中不包含但對該項(xiàng)檢測必須的組份，公司應(yīng)列出有關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其它有關(guān)信息。（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)公司、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號等具體信息。3.【儲存條件及使用期】試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)規(guī)定等。4.【樣本規(guī)定】重點(diǎn)明確下列內(nèi)容：（1）樣本采集時間點(diǎn)的選擇：與否受臨床癥狀、用藥狀況等因素的影響；（2）對采樣拭子、容器及保存液的規(guī)定：對采樣拭子的材質(zhì)規(guī)定（涉及對拭子頭和拭子桿的規(guī)定）、保存容器、轉(zhuǎn)運(yùn)保存液的規(guī)定、轉(zhuǎn)運(yùn)條件等（3）樣本采集：具體采集部位及類型，詳述具體的操作辦法或列出有關(guān)操作指南文獻(xiàn)以指導(dǎo)使用者（最佳能夠給出具體圖示），盡量減少由于樣本采集或解決不當(dāng)對實(shí)驗(yàn)造成的影響（4）樣本解決及保存：核酸提取前的預(yù)解決、保存條件及期限（短期、長久）、運(yùn)輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前與否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)限制。5.【合用機(jī)型】全部合用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)顧客操作。6.【檢查辦法】具體闡明實(shí)驗(yàn)操作的各個環(huán)節(jié)，涉及：（1）實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。（2）試劑配制辦法、注意事項(xiàng)。（3）詳述待測樣本及有關(guān)對照品（質(zhì)控品）核酸提取的條件、環(huán)節(jié)及注意事項(xiàng)。（4）核酸提取辦法的具體介紹。（5）擴(kuò)增反映前準(zhǔn)備：加樣體積、次序等。（6）RT-PCR各階段的溫度、時間設(shè)立、循環(huán)數(shù)設(shè)立及有關(guān)注意事項(xiàng)。（7）儀器設(shè)立：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記狀況看待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。（8）基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇辦法。7.【檢查成果的解釋】結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以及樣本管靶基因檢測成果的Ct值，以列表的形式對全部可能出現(xiàn)的成果組合及對應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)成果的解決方式一并詳述。另外，如果PCR體系中包含了兩個或以上的熒光探針對靶基因序列進(jìn)行檢測，則在成果解釋時，應(yīng)對每個探針?biāo)鶎?yīng)熒光通道的Ct值的成果及可能產(chǎn)生的成果組合均進(jìn)行合理解釋。闡明對何種條件下需要進(jìn)行重復(fù)檢測以及在重復(fù)檢測時看待測樣本可能采用的優(yōu)化條件等進(jìn)行詳述。8．【檢查辦法局限性】（1）本試劑盒的檢測成果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其它實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反映等狀況綜合考慮。（2）有關(guān)假陰性成果的可能性分析=1\*GB3①不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及解決、樣本中病毒滴度過低都有可能造成假陰性成果。=2\*GB3②流感病毒待測靶序列的變異或其它因素造成的序列變化可能會造成假陰性成果。=3\*GB3③對于突發(fā)的新型甲型流感病毒，其檢測的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時間可能尚未確認(rèn)，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會減少假陰性成果的可能性。=4\*GB3④未經(jīng)驗(yàn)證的其它干擾或PCR克制因子，如……等可能會造成假陰性成果（如有）。9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述下列性能指標(biāo)：（1）對對應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合狀況。（2）最低檢測限（分析敏捷度）：闡明試劑的最低檢出濃度，建議采用生物學(xué)方式表達(dá)病毒滴度，如TCID50或PFU的形式，簡樸介紹最低檢測限的擬定辦法以及對最低檢測限驗(yàn)證所采用的病毒株信息。（3）公司內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，簡樸介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品構(gòu)成、來源以及濃度梯度設(shè)立等信息。（4）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價原則。（5）分析特異性=1\*GB3①甲。=2\*GB3②交叉反映：易產(chǎn)生交叉反映的其它病原體核酸的驗(yàn)證狀況，建議以列表的方式表達(dá)通過交叉反映驗(yàn)證的病原體名稱、型別、濃度等信息；=3\*GB3③干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測成果的影響，如血液、粘蛋白、膿液等；=4\*GB3④藥品影響：治療感冒或其它呼吸道癥狀患者外用或內(nèi)服的常見藥品對檢測成果的影響，如常見抗感冒藥品、糖皮質(zhì)激素、抗生素、中藥等。（6）對比實(shí)驗(yàn)研究（如有）：簡要介紹參比試劑（辦法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)辦法及統(tǒng)計分析成果。10.【注意事項(xiàng)】應(yīng)最少涉及下列內(nèi)容：（1）有關(guān)人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）或其它可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項(xiàng)目的檢測，但截至現(xiàn)在，沒有任何一項(xiàng)檢測能夠確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組份作為潛在傳染源看待。（2）實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)；實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），實(shí)驗(yàn)操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不得交叉使用；各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定，最大程度避免交叉污染；實(shí)驗(yàn)用消耗品（如離心管、吸頭等）應(yīng)有合理的清潔和質(zhì)檢程序，避免RNA酶污染或擴(kuò)增反映克制物造成假陰性成果。（三）擬定產(chǎn)品原則及編制闡明擬定產(chǎn)品原則應(yīng)符合《方法》和《體外診療試劑注冊申報資料基本規(guī)定》的有關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（），將擬申報產(chǎn)品的重要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于原則正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因的基因位點(diǎn)、全序列，引物/探針序列、來源及驗(yàn)證狀況，多種酶的來源、特性以及驗(yàn)證等重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。流感病毒核酸檢測試劑的注冊檢測應(yīng)重要涉及下列性能指標(biāo)：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽性對照品（質(zhì)控品）的Ct值規(guī)定（涉及內(nèi)標(biāo)）、陽性/陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析敏捷度）等。陽性參考品重要考察對不同來源的病毒株、不同滴度的檢測符合性，對于甲型流感病毒核酸通用型檢測試劑，在此還應(yīng)考慮不同亞型的覆蓋檢測能力。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反映）的驗(yàn)證，應(yīng)重要涉及易發(fā)生交叉反映的其它病原體的假陽性狀況的考核。如果擬申報試劑已有對應(yīng)的國家/行業(yè)原則公布，則公司原則的規(guī)定不得低于上述原則規(guī)定。（四）注冊檢測根據(jù)《方法》規(guī)定，初次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)在國家食品藥品監(jiān)督管理局承認(rèn)的、含有對應(yīng)承檢范疇的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行持續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已有國標(biāo)品的流感病毒項(xiàng)目，在注冊檢測時應(yīng)采用對應(yīng)的國標(biāo)品進(jìn)行,對于現(xiàn)在尚無國標(biāo)品的項(xiàng)目，生產(chǎn)公司應(yīng)建立自己的參考品體系并提供對應(yīng)的內(nèi)部參考品。（五）重要原材料研究資料應(yīng)提供重要原材料如引物、探針、公司參考品或原則品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控原則等的有關(guān)研究資料。若重要原材料為公司自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如重要原材料購自其它供貨商，應(yīng)提供的資料涉及：對物料供應(yīng)商審核的有關(guān)資料、供貨方提供的質(zhì)量原則、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢查資料。1．核酸分離/純化組分（如有）的重要構(gòu)成、原理介紹及有關(guān)的驗(yàn)證資料。2．RT-PCR組分的重要材料（涉及引物、探針、多種酶及其它重要原料）的選擇、制備、質(zhì)量原則及實(shí)驗(yàn)研究資料，重要涉及下列內(nèi)容：（1）脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的構(gòu)成成分，涉及：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等驗(yàn)證資料。（2）引物由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，普通采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它適宜辦法純化。需提供對序列精確性、純度、穩(wěn)定性、功效性實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證資料。如為外購，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳成果或HPLC分析圖譜。（3）探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它適宜辦法純化，在5'-端(和/或3'-端)進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其它適宜辦法純化。純度應(yīng)達(dá)成HPLC純，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。（4）PCR反映所需酶DNA聚合酶，應(yīng)含有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），含有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗(yàn)證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。3.對照品（質(zhì)控品）的原料選擇、制備、定值過程及實(shí)驗(yàn)資料。4.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。（六）重要生產(chǎn)工藝及反映體系的研究資料基本生產(chǎn)工藝重要涉及：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的多種原材料及其配比應(yīng)符合規(guī)定，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等核心參數(shù)進(jìn)行有效控制。生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對反映體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反映條件、質(zhì)控體系設(shè)立、Ct（臨界）值擬定等，提供確切的根據(jù)，重要涉及下列內(nèi)容：1.重要生產(chǎn)工藝介紹，能夠圖表方式表達(dá)。2.反映原理介紹。3.基因位點(diǎn)選擇、RT-PCR辦法學(xué)特性介紹。4.擬定最佳RT-PCR反映體系的研究資料，涉及酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。5.擬定RT-PCR反映各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。6．對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）擬定的研究資料。7.不同合用機(jī)型的反映條件如果有差別應(yīng)分別詳述。另外，對于試劑盒的對照（質(zhì)控）品設(shè)立，建議公司參考下列規(guī)定執(zhí)行：（1）流感病毒核酸檢測試劑盒的外部對照（質(zhì)控）品應(yīng)最少設(shè)立臨界陽性對照（質(zhì)控）品和陰性對照（質(zhì)控）品，均應(yīng)參加樣本核酸的平行提取，以對核酸提取、RT-PCR反映過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制，公司應(yīng)對多種對照（質(zhì)控）品的Ct值做出明確的范疇規(guī)定。注意，建議采用與實(shí)際檢測樣本含有相似或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對照（質(zhì)控）品，不推薦采用水作為陰性對照（質(zhì)控）品。（2）（3）有關(guān)對照品的原料選擇：內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）應(yīng)采用品有蛋白外殼的病毒顆粒，如滅活的流感病毒或缺點(diǎn)病毒（假病毒）等，外部陽性對照能夠采用滅活病毒、假病毒或質(zhì)粒。（七）分析性能評定資料公司應(yīng)提交原廠在產(chǎn)品研制階段對試劑盒進(jìn)行的全部性能驗(yàn)證的研究資料，涉及具體研究辦法、內(nèi)控原則、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等具體資料。對于流感病毒核酸類定性檢測試劑，建議著重對下列分析性能進(jìn)行研究。1.流感病毒核酸（RNA）提取病毒RNA提取重要有下列目的：富集靶核酸濃度、確保靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR克制物，是決定RT-PCR成敗的要素之一。RNA極易受RNA酶（RNase）的降解，而臨床標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在大量的RNase，因此，無論申報產(chǎn)品與否含有RNA分離/純化的組分，公司都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做充足的驗(yàn)證。除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有對應(yīng)的純化環(huán)節(jié)，盡量去除PCR克制物。傳統(tǒng)的RNA分離純化辦法（如表面活性劑加蛋白酶結(jié)合氯仿-酚抽提法）和改良辦法（如硅磁性微粒吸附法）都有或多或少的優(yōu)勢和局限性，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇RNA分離/純化試劑，并提供具體的驗(yàn)證資料。2.最低檢測限（分析敏捷度）（1）最低檢測限的擬定建議使用培養(yǎng)后病毒原液的梯度稀釋液進(jìn)行最低檢測限擬定，每個梯度的病毒稀釋液重復(fù)3-5份，每份進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，將含有90%-95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限。通過另制備最少5份最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對90%-95%的檢出率進(jìn)行確認(rèn)。建議采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50%tissuecultureinfectiousdose，TCID50）、空斑形成單位（plaqueformingunits，PFU）法或copies/ml的方式進(jìn)行病毒濃度確認(rèn)，并采用上述方式作為病毒濃度的表達(dá)方式。在進(jìn)行最低檢測限確實(shí)認(rèn)時，參加研究的甲型流感病毒各亞型和乙型流感病毒應(yīng)最少涉及不同來源的兩個含有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。（2）最低檢測限的驗(yàn)證申報試劑應(yīng)在最低檢測限或靠近最低檢測限的病毒濃度對每種常見待測流感病毒亞型含有時間和區(qū)域特性性的最少3個病毒株進(jìn)行驗(yàn)證。對此，公司應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗(yàn)證的各個病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)實(shí)驗(yàn)等信息。用于最低檢測限擬定和驗(yàn)證的病毒株如涉及疫苗株，則其應(yīng)能夠體現(xiàn)近來流感發(fā)病季的病毒特點(diǎn)。3.分析特異性（1）交叉反映=1\*GB3①用于流感病毒核酸檢測試劑交叉反映驗(yàn)證的病原體種類重要考慮下列幾方面可能性：核酸序列含有同源性、易引發(fā)相似或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其它微生物。=2\*GB3②建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)有關(guān)水平進(jìn)行交叉反映的驗(yàn)證。普通，細(xì)菌感染的水平為106cfu/ml或更高，病毒為105pfu/ml或更高。=3\*GB3③首先，應(yīng)在流感病毒不同型別和亞型間進(jìn)行交叉反映驗(yàn)證；另一方面，采用其它的病原微生物進(jìn)行驗(yàn)證（見表1）。=4\*GB3④申請人應(yīng)提供全部用于交叉反映驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等實(shí)驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反映驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品闡明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。表1建議用于交叉反映性研究的微生物微生物類型腺病毒3型腺病毒7型人冠狀病毒巨細(xì)胞病毒腸道病毒人副流感病毒1、2、3型

麻疹病毒人偏肺病毒流行性腮腺炎病毒呼吸道合胞病毒B型鼻病毒1A型百日咳桿菌肺炎衣原體棒狀桿菌*大腸桿菌*流感嗜血桿菌乳桿菌*卡他莫拉菌*無毒結(jié)核分枝桿菌肺炎支原體腦膜炎奈瑟菌淋球菌*銅綠假單胞菌*金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌*肺炎鏈球菌化膿鏈球菌唾液鏈球菌*項(xiàng)：選擇性驗(yàn)證（2）干擾物質(zhì)=1\*GB3①潛在的干擾物質(zhì)重要涉及：血液、鼻分泌物或粘液、用于緩和鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和過敏癥狀的藥品（見表2）。=2\*GB3②使用醫(yī)學(xué)有關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，另外，建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評價。=3\*GB3③申請人應(yīng)采用每種流感病毒亞型的最少兩種病毒株對呼吸道樣本中物質(zhì)的潛在克制影響進(jìn)行評定，建議在每種流感病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。表2建議用于干擾研究的物質(zhì)物質(zhì)活性成分舉例粘蛋白純化粘蛋白人血液鼻腔噴霧劑或滴鼻劑腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液鼻腔糖皮質(zhì)激素倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松鼻用凝膠硫磺過敏性癥狀緩和藥品金英潤喉片、口服麻醉劑和鎮(zhèn)痛劑苯唑卡因、薄荷腦抗病毒藥品扎那米韋抗生素、鼻用軟膏莫匹羅星全身抗菌藥妥布霉素4.精密度測量精密度的評價辦法并無統(tǒng)一的原則可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特性或公司的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須確保研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)辦法能夠參考有關(guān)的CLSI-EP文獻(xiàn)或國內(nèi)有關(guān)體外診療產(chǎn)品性能評定的文獻(xiàn)進(jìn)行。公司應(yīng)對每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評價原則做出合理規(guī)定，如原則差或變異系數(shù)的范疇等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價重要涉及下列規(guī)定。（1）對可能影響檢測精密度的重要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報試劑（涉及提取組分和RT-PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行有關(guān)的驗(yàn)證。（2）合理的精密度評價周期，例如：為期最少20天的持續(xù)檢測，每天最少由2人完畢不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對室間精密度進(jìn)行評價。（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)最少涉及三個水平:=1\*GB3①陰性質(zhì)控品：待測物濃度低于最低檢測限或?yàn)榱銤舛龋幮詸z出率應(yīng)為100%（n≥20）。=2\*GB3②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。=3\*GB3③陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。另外，建議申請人選擇適量臨床采集的新鮮病人樣本（涉及全部樣本類型）作為無靶值質(zhì)控品進(jìn)行精密度評價，以更加好地模仿臨床檢測環(huán)境。5.陽性/陰性參考品如申報產(chǎn)品有對應(yīng)的國家參考品，則公司內(nèi)部陽性/陰性參考品應(yīng)參考國家參考品的項(xiàng)目設(shè)立。在不低于國家參考品規(guī)定的前提下，申請人能夠結(jié)合實(shí)際狀況設(shè)立合理的公司內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際狀況自行設(shè)定公司內(nèi)部參考品，陽性參考品應(yīng)著重考慮病毒型別、亞型及滴度規(guī)定，陰性參考品則重要涉及對分析特異性（交叉反映）的驗(yàn)證狀況。。6.其它需注意問題對于合用多個機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品闡明書【合用機(jī)型】項(xiàng)中所列的全部型號儀器的性能評定資料。（八）參考值（參考范疇）擬定資料對于這類試劑，參考值擬定資料重要是指Ct值確實(shí)認(rèn)資料，建議申請人采用受試者工作特性（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于成果判斷的臨界值予以確認(rèn)。（九）穩(wěn)定性研究資料穩(wěn)定性研究資料重要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和合用樣本的穩(wěn)定性研究。前者重要涉及實(shí)時穩(wěn)定性（使用期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)涉及研究辦法的擬定根據(jù)、具體的實(shí)施方案、具體的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供最少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品使用期后的研究資料。考慮到病毒RNA極易被降解的特性，公司也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，重要涉及冷藏和冷凍兩種條件下的使用期驗(yàn)證，能夠在合理的溫度范疇內(nèi)選擇3-5個溫度點(diǎn)（應(yīng)最少涉及范疇的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。在對樣本進(jìn)行效期穩(wěn)定性的評價時，同時應(yīng)對推薦使用的采樣拭子、樣本保存液及保存容器進(jìn)行合理驗(yàn)證。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究成果均應(yīng)在闡明書【儲存條件及使用期】和【樣本規(guī)定】兩項(xiàng)中進(jìn)行具體闡明。（十）臨床實(shí)驗(yàn)研究1.研究辦法對于已有同類產(chǎn)品上市的試劑的臨床研究，選擇境內(nèi)已同意上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（下列稱考核試劑）與之進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。另外，申請人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的新鮮采集樣本進(jìn)行考核試劑與流感病毒檢測的“金原則”辦法--病毒分離培養(yǎng)鑒定辦法的比較研究，每種樣本類型不少于30例經(jīng)病毒分離培養(yǎng)辦法擬定為陽性的樣本。對于無法選擇參比試劑的新型流感病毒核酸檢測試劑，其臨床研究應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定和/或病毒核酸序列測定辦法作為參比辦法，總例數(shù)不少于500例。用于核酸序列測定的引物序列應(yīng)不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。另外，對于已被同意上市的甲型流感病毒核酸（通用型）檢測試劑，如果在其注冊證使用期內(nèi)出現(xiàn)了新型甲型流感病毒的暴發(fā)流行，如有需要，生產(chǎn)公司應(yīng)快速針對新的流感亞型開展臨床比對研究，能夠采用病毒檢測的“金原則”辦法或當(dāng)時衛(wèi)生行政部門承認(rèn)的針對該新型甲型流感病毒亞型的診療原則作為參比辦法進(jìn)行臨床比對研究，分別對采集自新型甲型流感病毒感染（陽性病例不少于30例）、其它常見的流感病毒亞型（如當(dāng)年流行的季節(jié)性甲型流感病毒）以及非流感病毒感染但含有流感樣癥狀的患者的新鮮樣本進(jìn)行比對實(shí)驗(yàn)研究，總例數(shù)不少于100例，如臨床實(shí)驗(yàn)研究成果能夠證明其對新型甲型流感病毒亞型的檢測能力，申請人在重新注冊時應(yīng)考慮到因病毒株變化而造成預(yù)期用途發(fā)生實(shí)際變化的因素，同時提出變更申請，并按有關(guān)法規(guī)規(guī)定提交分析性能評定和臨床實(shí)驗(yàn)研究等資料。2.臨床研究單位的選擇考慮到流感病毒不同病毒株的區(qū)域性特性較強(qiáng)，故建議申請人在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究單位應(yīng)含有呼吸道疾患診療和分子生物學(xué)辦法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和參比辦法都應(yīng)處在有效的質(zhì)量控制下，最大程度確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確性及可重復(fù)性。3.臨床實(shí)驗(yàn)方案臨床實(shí)驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢查醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)立應(yīng)基本一致，且確保在整個臨床實(shí)驗(yàn)過程中遵照預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完畢，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，特別是數(shù)據(jù)收集過程。實(shí)驗(yàn)方案中應(yīng)擬定嚴(yán)格的病例納入/排除原則，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)統(tǒng)計在案并明確闡明因素。在實(shí)驗(yàn)操作過程中和鑒定實(shí)驗(yàn)成果時應(yīng)采用盲法以確保實(shí)驗(yàn)成果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機(jī)型應(yīng)完全一致，方便進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，考核試劑的樣本類型不應(yīng)超越參比試劑對樣本類型的檢測規(guī)定，如果選擇了參比試劑合用樣本類型以外的樣本，則應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定或其它合理辦法對額外的樣本類型進(jìn)行驗(yàn)證。4.病例選擇及樣本類型臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇含有流感癥狀/體征(例如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發(fā)熱、頭疼、肌痛)、流感相似癥狀或有親密接觸史的人群作為研究對象?；颊吡鞲邪Y狀出現(xiàn)后，流感病毒在鼻腔或氣管分泌物中的濃度在24-48小時內(nèi)將保持較高水平，但在不同年紀(jì)段人群可能有一定差別，在小朋友體內(nèi)的持續(xù)時間更長。申請人在建立病例納入原則時，應(yīng)考慮到各年紀(jì)段人群的差別，盡量覆蓋各個年紀(jì)段人群。在進(jìn)行成果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的規(guī)定外，建議對各年紀(jì)段人群分層進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對于新型甲型流感病毒亞型核酸檢測試劑，如新型甲型流感病毒（流行株）、高致病性禽流感病毒H5亞型等，其臨床研究所選擇病例除新型甲型流感病毒感染者及親密接觸者外，還應(yīng)涉及其它當(dāng)年流行的季節(jié)性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但含有流感樣癥狀的患者等。其臨床研究應(yīng)能夠體現(xiàn)該產(chǎn)品對新型甲型流感病毒核酸檢測的特異性。臨床實(shí)驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測中慣用的樣本類型。普通，我們建議對于每種樣本類型應(yīng)有不少于100例的陽性病例，對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反映的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。5.統(tǒng)計學(xué)分析對臨床實(shí)驗(yàn)成果的統(tǒng)計應(yīng)選擇適宜的統(tǒng)計辦法，如檢測成果一致性分析、受試者工作特性（ROC）曲線分析、陰/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測成果，對定性成果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢查以驗(yàn)證兩種試劑定性成果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)能夠證明兩種辦法的檢測成果無明顯統(tǒng)計學(xué)差別。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢查假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑與否等效的原則。6.成果差別樣本的驗(yàn)證在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測成果不一致的樣本，應(yīng)采用“金原則”辦法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差別因素及可能成果進(jìn)行分析。7.臨床實(shí)驗(yàn)總結(jié)報告撰寫根據(jù)《體外診療試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定，臨床實(shí)驗(yàn)報告應(yīng)當(dāng)對實(shí)驗(yàn)的整體設(shè)計及各個核心點(diǎn)予以清晰、完整的論述，應(yīng)當(dāng)對整個臨床實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程、成果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)涉及必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析辦法。建議在臨床總結(jié)報告中對下列內(nèi)容進(jìn)行詳述。（1）臨床實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計及方案描述=1\*GB3①臨床實(shí)驗(yàn)的整體管理狀況、臨床研究單位選擇、臨床重要研究人員介紹等基本狀況介紹。=2\*GB3②病例納入/排除原則、不同年紀(jì)段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及原則。=3\*GB3③樣本類型，樣本的收集、解決及保存等。=4\*GB3④統(tǒng)計學(xué)辦法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計成果的原則。（2）具體的臨床實(shí)驗(yàn)狀況=1\*GB3①申報試劑和參比試劑的名稱、批號、使用期及所用機(jī)型等信息。=2\*GB3②對各研究單位的病例數(shù)、年紀(jì)分布狀況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及比例。=3\*GB3③質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行狀況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查成果評定。=4\*GB3④具體實(shí)驗(yàn)過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長久保存、成果不一致樣本的校驗(yàn)等。（3）統(tǒng)計學(xué)分析=1\*GB3①數(shù)據(jù)預(yù)解決、差別數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗(yàn)證以及與否納入最后數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的解決、研究過程中與否涉及對方案的修改。=2\*GB3②陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。=