腎安提取液對(duì)sz誘導(dǎo)糖尿病小鼠腎臟gf-

腎安提取液對(duì)sz誘導(dǎo)糖尿病小鼠腎臟gf-

糖尿病性腎炎（dn）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。發(fā)病率約占題患者的35.40%，是現(xiàn)在pm患者死亡的主要原因。DN為難治病之一,已為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所公認(rèn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1)是目前比較公認(rèn)的DN發(fā)生發(fā)展的核心因子,在DN腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的積聚及足細(xì)胞損傷中無(wú)發(fā)揮著重要作用。本研究主要探討腎安提取液對(duì)DN小鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的干預(yù)作用。腎安提取液amesTRIzolReagent(美國(guó)Invitrogen公司);RNA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄(TOYOBO公司,日本);SYBRGreenmix(TOYOBO公司,日本);免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(GENETECH公司);兔抗小鼠TGF-β1、遷黏蛋白(fibronectin,FN)及Smad7多克隆抗體(Santacruz公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(KPL公司)。8周齡雄性C57BL/6小鼠54只,清潔級(jí),體質(zhì)量18-22g[購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào):SCXK(湘)2009-0004]。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、厄貝沙坦組、腎安低、中、高劑量組,每組各9只。適應(yīng)環(huán)境1周后,禁食12h,將鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美國(guó)Sigma公司)溶于pH4.8檸檬酸緩沖液中,除正常對(duì)照組外,均按150mg/kg單次性腹腔注射STZ,72h后尾尖取血,測(cè)血糖,血糖>16.17mmol/L者為建模成功。同時(shí)正常對(duì)照組腹腔注射等量無(wú)菌檸檬酸緩沖液。腎安提取液由黃芪甲苷(黃芪提取物)、淫羊藿苷(淫羊藿提取物)、1,8二羥基蒽醌(大黃提取物)(均購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)按比例為:2.5∶1.8∶2.8配制,用0.3%羧甲基纖維素鈉配制成0.3029mg/mL備用。腹腔注射STZ72h后,正常對(duì)照組、模型組小鼠灌服蒸餾水10mL·kg-1·d-1;厄貝沙坦組灌服厄貝沙坦(杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司)10mg·kg-1·d-1(蒸餾水稀釋至10mL/kg);腎安各劑量組分別灌服腎安提取液2.272、4.544、9.088mg·kg-1·d-1(均蒸餾水稀釋至10mL/kg)。持續(xù)4周。給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1d,用代謝籠收集24h尿液,計(jì)24h尿量,考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)尿蛋白濃度,并計(jì)算24h尿蛋白量。給藥前尾尖取血,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、血肌酐(serumcreatinine,Scr);藥物干預(yù)結(jié)束后用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,稱重,摘眼球取血,同法檢測(cè)血糖、Scr;取腎臟,去包膜清洗后精密電子天平稱重,按下式計(jì)算相腎質(zhì)量指數(shù)(KW/BW)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);取左腎用4%多聚甲醛固定,用于病理切片,右腎-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?00mg腎皮質(zhì),加入RIPA緩沖液,裂解腎組織,PMSF提取總蛋白,Bradford比色法測(cè)定蛋白含量。取組織蛋白100μg,經(jīng)10%SDS凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,5%的脫脂奶粉-PBST溶液室溫封閉1h。加一抗4℃孵育過(guò)夜,PBST清洗3×15min,加入二抗,室溫孵育1h。ECL系統(tǒng)顯影,X線壓片曝光,β-actin為內(nèi)參照。用圖像分析軟件(UVItec,英國(guó))對(duì)X線片上雜交條帶進(jìn)行灰度分析,確定X線片上雜交條帶的相對(duì)吸光度值。染色具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3μm厚的腎組織石蠟包埋塊切片,脫蠟、水化,微波抗原修復(fù)10min;羊血清封閉,室溫下20min;滴加1:100的一抗,37℃1h;生物素標(biāo)記的二抗工作液,37℃1h;DAB顯色。結(jié)果判定(半定量評(píng)分):隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野(×200),采用HMIAS2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)做半定量分析,分別計(jì)算陽(yáng)性染色面積占1個(gè)視野面積的百分比,取平均值。取左腎皮質(zhì)部修成0.5mm3的小塊,用10%中性福爾馬林及2.5%戊二醛混合固定液前固定,1%四氧化鋨后固定,梯度乙醇脫水,包埋后切片,醋酸鈾與枸櫞酸鉛雙重染色,置于透射電鏡下觀察。每只小鼠隨機(jī)取1份標(biāo)本,每份標(biāo)本在電鏡下拍攝3個(gè)視野。每張圖片中測(cè)量基底膜最寬處作為部位,取3張圖片的平均值為每例動(dòng)物腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)厚度值。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析。腎安對(duì)質(zhì)構(gòu)及腎質(zhì)及smad7蛋白表達(dá)的影響模型組及腎安低劑量組各有1只小鼠分別于第3周、第4周意外死亡。給藥前,各組血糖與正常對(duì)照組比較,有極顯著性差異(P<0.01),但與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組尿蛋白定量與正常對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥后,除正常對(duì)照組外,各組血糖、尿蛋白定量與給藥前比較,有顯著性差異(P<0.05,P<0.01);給藥后,其它各組血糖、尿蛋白定量與正常對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0.01);各藥物干預(yù)組血糖與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各藥物干預(yù)組尿蛋白與模型組比較,有極顯著性差異(P<0.01),腎安高劑量組與厄貝沙坦組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。見(jiàn)表1。各組腎質(zhì)量指數(shù)、腎小球硬化指數(shù)與正常對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0.01);與模型組比較,腎安高劑量組和厄貝沙坦組腎質(zhì)量指數(shù)降低,有顯著差異(P<0.05,P<0.01),兩組間則無(wú)顯著差異;各藥物干預(yù)組腎小球硬化指數(shù)均顯著改善(P<0.05,P<0.01),腎安高、中劑量組與厄貝沙坦組比較,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。各組TGF-β1mRNA與正常對(duì)照組比較,有極顯著性差異(P<0.01);而厄貝沙坦組和腎安各劑量組與模型組比較均有顯著降低(P<0.01);腎安高劑量組與厄貝沙坦組比較,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。正常對(duì)照組小鼠腎皮質(zhì)TGF-β1蛋白水平很低,其它各組小鼠腎皮質(zhì)TGF-β1蛋白顯著表達(dá)高于正常對(duì)照組,有極顯著性差異(P<0.01);藥物干預(yù)各組TGF-β1蛋白表達(dá)與模型組比較,有極顯著性差異(P<0.01);腎安高劑量組與厄貝沙坦組TGF-β1蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表4,圖1。FN主要表達(dá)于系膜區(qū)、GBM及腎小管基膜,呈棕色。正常對(duì)照組FN染色較弱,染色面積極少;模型組及各藥物干預(yù)組FN與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01);各藥物干預(yù)組與模型組比較均有顯著降低(P<0.05,P<0.01);腎安高劑量組與厄貝沙坦組比較,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。免疫組化顯示,Smad7主要表達(dá)于系膜區(qū)、GBM基膜,呈棕色。正常對(duì)照組小鼠腎皮質(zhì)Smad7蛋白表達(dá)很低;模型組表達(dá)則顯著升高,明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。藥物干預(yù)各組腎皮質(zhì)Smad7蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P<0.01);腎安高劑量組與厄貝沙坦組對(duì)腎皮質(zhì)Smad7蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表6。正常對(duì)照組GBM厚度均一,可見(jiàn)3層結(jié)構(gòu),足細(xì)胞是附著于GBM;模型組GBM增厚明顯,呈均一性,足細(xì)胞減少、消失,GBM裸露;厄貝沙坦組及腎安各組,GBM均出現(xiàn)不同程度增厚,部分呈節(jié)段性,足細(xì)胞不同程度減少,足突融合;厄貝沙坦組及腎安高劑量組病變最輕。與正常對(duì)照組比較,模型組及各藥物干預(yù)組GBM明顯增厚(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,藥物干預(yù)后,各組GBM厚度明顯改善(P<0.05,P<0.01);腎安中、高劑量組GBM厚度與厄貝沙坦組無(wú)顯著差異。見(jiàn)表7,圖2。腎安提取液、化療藥物與腎相關(guān)性傳統(tǒng)觀念認(rèn)為DM屬“消渴”范疇,其病機(jī)為陰虛燥熱。DN是DM最常見(jiàn)并發(fā)癥之一,一直以來(lái),許多學(xué)者把陰虛或氣陰兩虛作為DN的基本病機(jī)。然而,隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展,診斷水平提高,降糖藥物的廣泛應(yīng)用,大多數(shù)患者“多飲、多食、多尿”的糖尿病典型癥狀(陰虛燥熱)早已被控制,或根本未出現(xiàn),而腎臟損害仍逐漸發(fā)生。因此,越來(lái)越多人對(duì)以“陰虛或氣陰兩虛”作為糖尿病腎病的基本病機(jī)提出質(zhì)疑。蛋白尿是診斷臨床糖尿病腎病的最主要依據(jù),劉罡等研究表明尿白蛋白排泄率與糖尿病中醫(yī)證候之間存在固有的聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),24h尿白蛋白排泄與糖尿病患者腎虛證的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腎為先天之本,生命之根,腎陽(yáng)對(duì)機(jī)體各器官起著溫煦和生化作用,吳朝妍等認(rèn)為腎陽(yáng)虛貫穿DN始終。張琪等[6認(rèn)為,腎氣從陽(yáng)則開(kāi),從陰則闔,腎陽(yáng)虛衰,關(guān)門(mén)不利則水邪益甚,氣損血行不利,必致瘀血內(nèi)生,腎虛血瘀是DN病理基礎(chǔ)。故我們以為本病以腎虛為本,氣虛為基本證型,陽(yáng)虛為發(fā)展趨勢(shì),瘀血始終貫穿其中。腎安提取液由黃芪甲苷(黃芪提取物)、淫羊藿苷(淫羊藿提取物)、1,8二羥基蒽醌(大黃提取物)組成,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芪溫補(bǔ)脾腎,利水退腫;淫羊藿“補(bǔ)命門(mén),益精氣”;大黃既能活血祛瘀,又能通腑泄?jié)帷Ｈ揭鏆鉁仃?yáng),活血化瘀,扶正祛邪,攻補(bǔ)兼施?，F(xiàn)代研究表明,黃芪、水蛭黃芪配方含藥血清均能阻止腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)入S期從而達(dá)到抑制增生的目的,且能提高其凋亡率。淫羊藿能擴(kuò)張血管、降低血壓,降低殘余腎小球內(nèi)壓力,減輕高灌注、高壓力對(duì)腎臟的危害。大黃可改善早期DN患者腎臟的高灌注、高濾過(guò)狀態(tài),延緩DN進(jìn)展。筆者觀察也發(fā)現(xiàn),腎安提取液能減少DN小鼠尿蛋白排泄,改善腎質(zhì)量指數(shù)及腎小球硬化指數(shù),延緩腎損害。DN病理變化主要表現(xiàn)為以腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)增多為特征的系膜區(qū)增寬、基底膜增厚,進(jìn)而出現(xiàn)腎小球硬化及腎小球入、出小動(dòng)脈玻璃樣變等病理表現(xiàn)。高糖及腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensionsystem,RAS)激活等導(dǎo)致的TGF-β1的表達(dá)增加,在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β1不僅能刺激系膜細(xì)胞活化增殖,分泌大量的膠原蛋白、FN及層黏蛋白等ECM成分;同時(shí),還能促進(jìn)這些細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白降解酶的抑制物,抑制ECM成分降解。RAS阻斷劑血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗劑能明顯下調(diào)DM腎組織中TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá),并改善腎臟局部血流動(dòng)力學(xué)異常,減輕DN病理變化,降低尿蛋白量,延緩腎功能損害等。我們的研究顯示,腎安提取液不僅能明顯降低DM小鼠腎皮質(zhì)TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá),對(duì)腎組織FN合成及GBM的增厚也有顯著抑制作用,而無(wú)明顯降血糖作用,提示其作用機(jī)制不是通過(guò)降血糖來(lái)實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),腎小球足細(xì)胞的凋亡、脫落致足細(xì)胞的減少在DN大量蛋白尿和腎小球硬化的也起著重要作用。Smad蛋白是TGF-β1信號(hào)通路的重要下游分子,Smad7在介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β1可能通過(guò)促進(jìn)Smad7的合成,進(jìn)而抑制核因子-κB的轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致足細(xì)胞的凋亡。研究表明,TGF-β1能強(qiáng)烈誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠和體外培養(yǎng)的足細(xì)胞內(nèi)Smad7蛋白的合成,且與足細(xì)胞凋亡程度存在明顯相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)也初步觀察到,由黃芪甲苷、淫羊藿苷、1,8-二羥基蒽醌組成腎安提取液,能明顯抑制DN小鼠腎皮質(zhì)Smad7蛋白表達(dá),并減輕腎小球足細(xì)胞的損傷。我們認(rèn)為其作用機(jī)制可能與該方抑制TGF-β1/Smad7信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),減少足細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此,筆者推論腎安提取液可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá),減輕ECM積聚,并抑制TGF-β1/Smad7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),減少足細(xì)胞凋亡,從而對(duì)DM腎損害起保護(hù)作用。1.試劑2.老鼠模型的構(gòu)建和組成3.給藥4.采集樣品、血液和尿液生化指標(biāo)的測(cè)定5.高效液相色譜法按Trizol(美國(guó)Invitrogen)說(shuō)明書(shū)提取各組腎皮質(zhì)總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)。TGF-β1引物:上游:5,-TCCCTCAACCTCAAATTATTCA-3,,下游:5,-GCGGTCCACCATTAGCAC-3,,產(chǎn)物493bp,退火溫度58℃;GAPDH引物:上游:5,-TCAACGGCACAGTCAAGG-3,,下游:5,-ACCAGTGGATGCAGGGAT-3,,產(chǎn)物470bp,退火溫度