極端嗜鹽菌sym菌株的形態(tài)、生理生化及淀粉酶學(xué)性質(zhì)研究

極端嗜鹽菌sym菌株的形態(tài)、生理生化及淀粉酶學(xué)性質(zhì)研究

淀粉酶是廣泛應(yīng)用的酶之一，也是第一個(gè)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶抑制劑之一。提高淀粉酶在極端環(huán)境下的穩(wěn)定性是改造淀粉酶的重要方向。研究者嘗試了不同的途徑以提高酶的熱穩(wěn)定性、耐鹽性、耐酸性、耐堿性,其中開發(fā)來自嗜熱菌、嗜鹽菌、嗜堿菌、嗜酸菌的淀粉酶是一種有效的途徑。前人關(guān)于嗜鹽菌淀粉酶的報(bào)道較少,而且通常一種菌產(chǎn)生的淀粉酶僅具備一、二種特性,只有少數(shù)能耐鹽和堿。極端嗜鹽古生菌是一類存在于天然高鹽域如海水曬鹽場、鹽湖及鹽堿湖中的古細(xì)菌,它們生長在高濃度NaCl的環(huán)境中,其菌種資源、生理生化和遺傳特性都具有比較高的研究和利用價(jià)值。筆者從江蘇省鹽城市的射陽鹽場,篩選得到嗜鹽菌SYM菌株,該菌株產(chǎn)生的淀粉酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,對(duì)NaCl和堿也有較強(qiáng)的耐受性,而且對(duì)這些條件又沒有依賴性——低鹽度和低pH值條件下仍有較高酶活,這對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究都有很大的意義。筆者從形態(tài)、生理生化和分子水平上對(duì)SYM菌株進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其產(chǎn)生的淀粉酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1菌株和菌株的分離菌樣采自鹽城的射陽鹽場結(jié)晶池,SYM菌株為實(shí)驗(yàn)室分離菌株,對(duì)照菌株Halorubrumsaccharovorum購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),菌種編號(hào)1.2147。1.2培養(yǎng)基的制備收集菌體培養(yǎng)基為Payne,富集及分離純化培養(yǎng)基為Gibbons,菌體生理特性測(cè)試培養(yǎng)基為A培養(yǎng)基(牛肉膏5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,NaCl200.0g/L,KCl5.0g/L,MgSO4·7H2O2.5g/L,pH值7),菌落形態(tài)觀察培養(yǎng)基為牛奶-鹽-瓊脂培養(yǎng)基,產(chǎn)酶培養(yǎng)基為修飾的A培養(yǎng)基(可溶性淀粉10.0g/L,牛肉膏5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,NaCl200.0g/L,KCl5.0g/L,MgSO4·7H2O2.5g/L,pH值7)。1.3菌株的培養(yǎng)和純化用BS溶液(NaCl200g/L,MgSO4·7H2O20g/L)懸浮泥樣中的菌體后,吸取2ml懸浮液于50mlPayne液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)5d,取富集液100μl于Gibbons固體平板上涂布接種,37℃光照培養(yǎng),待菌落長出后,挑取單菌落反復(fù)劃線純化直至獲得純菌株。純菌株在改進(jìn)的Gibbons培養(yǎng)基(含1%可溶性淀粉)固體平板點(diǎn)接,37℃光照培養(yǎng)5~7d,用盧戈氏碘液檢測(cè)透明圈,挑取透明圈大的菌株。1.4sym菌株的識(shí)別1.4.1對(duì)sm植物的形態(tài)的評(píng)價(jià)將純化得到的菌株接種于牛奶-鹽-瓊脂培養(yǎng)基37℃光照培養(yǎng)7d,采用Dussault方法革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。1.4.2對(duì)sm植物的生理生化性質(zhì)的評(píng)價(jià)主要參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等,并依據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程》對(duì)菌體細(xì)胞壁的甘油二醚衍生物進(jìn)行測(cè)定。1.4.3引物、反應(yīng)條件用苯酚-氯仿混合提取法提取模板DNA,并于-20℃保存。PCR擴(kuò)增的正向引物為5′-attccggttgatcctgc-3′,反向引物為5′-aggaggtgatccagccgcag-3′。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸3min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min。得到序列用GenBankBlast程序進(jìn)行同源性比較,采用DNAMAN軟件和Clustalx1.83比對(duì)分析序列后,用MEGA3.1軟件的Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)樹構(gòu)建。1.5生長因子及ph值對(duì)syn生長的影響用含不同NaCl濃度的A培養(yǎng)基(pH值7.0),在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)5d,研究NaCl濃度對(duì)SYM菌株生長的影響。用含3mol/LNaCl,0~1mol/LMg2+的A培養(yǎng)基(pH值7.0),在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)5d,研究Mg2+濃度對(duì)SYM菌株生長的影響。用不同pH值的A培養(yǎng)基(NaCl濃度為3mol/L,Mg2+濃度為10mmol/L),于37℃,200r/min條件下培養(yǎng)5d,研究pH值對(duì)SYM生長的影響。用A培養(yǎng)基(pH值7.0,NaCl濃度為3mol/L,Mg2+濃度為10mmol/L),200r/min條件下,在15~55℃范圍內(nèi)研究溫度對(duì)SYM生長的影響。1.6粗酶溶液的制備用產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液4℃離心收集上清液,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.7na-robison-robison吸光度的測(cè)定淀粉酶反應(yīng)體系為:1.0ml反應(yīng)液含0.1ml粗酶液,0.2ml1%(W/V)淀粉溶液和50mmol/L的Britton-Robison緩沖液,在70℃反應(yīng)10min后加1mlDNS試劑終止反應(yīng),并在100℃顯色5min,測(cè)其在520nm處的吸光值。1個(gè)酶活力單位(U)定義為1min1ml培養(yǎng)基釋放的還原糖的量等同于1μmol葡萄糖的酶量。2結(jié)果與分析2.1生長目標(biāo)從射陽鹽場篩選得到1株極端嗜鹽古細(xì)菌SYM菌株,達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間為96h,生長的NaCl濃度范圍為1.5~5.3mol/L,最適NaCl濃度為4mol/L(圖1A);生長的Mg2+濃度范圍為0~800mmol/L,最適Mg2+濃度為200mmol/L(圖1B);生長的pH值范圍為6.5~9.5,最適pH值為7.5(圖1C);生長的溫度范圍為25~55℃,最適溫度為40℃(圖1D)。2.2細(xì)菌和細(xì)菌的形態(tài)SYM菌株呈球狀,革蘭氏染色呈陰性,不具運(yùn)動(dòng)性;菌落顏色為橙紅色,菌落形態(tài)呈半球狀。2.3菌株鑒定結(jié)果菌體細(xì)胞壁的甘油二醚衍生物薄層層析結(jié)果顯示,在Rf值為0.2處(如圖2中箭頭所示)有明顯的甘油二醚衍生物斑點(diǎn),對(duì)照菌株為Halorubrumsaccharovorum。對(duì)菌株SYM菌株進(jìn)行有關(guān)生理生化鑒定結(jié)果見表1,SYM菌株與相近屬種生理生化特性比較見表2。SYM菌株與鹽深紅菌屬相近種和特征種之間生理生化特性比較顯示,該菌株屬于鹽深紅菌屬,而且與鹽深紅菌屬內(nèi)Halorubrumsodomense種相似性較高。2.4ssity基因的分析根據(jù)SYM菌株的16SrDNA序列(GenBankaccessionnumber:EU365395)與嗜鹽菌科各屬的特征種的16SrDNA序列,使用Clustalx1.83和MEGA3.1軟件,利用Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。結(jié)果顯示,SYM菌株屬于Halorubrum屬。將SYM菌株的16SrDNA序列與Halorubrum屬的主要種之間構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并采用DNAMAN軟件比對(duì)序列可得SYM菌株與菌種Halorubrumdistributum具有98.23%同源性。用GenBankBlast程序,直接比對(duì)結(jié)果也將SYM菌株與嗜鹽古菌Halorubrumdistributum歸為一支(結(jié)果未顯示)。2.5反應(yīng)溫度的確定在3mol/LNaCl濃度,37℃下培養(yǎng)5d,培養(yǎng)液上清中胞外淀粉酶酶活達(dá)290U/ml左右。該淀粉酶在pH值5.5、0.15~2.65mol/LNaCl、50mmol/L的NaAc-HAc溶液中,37℃反應(yīng)10min,結(jié)果顯示在1.15mol/LNaCl時(shí),酶活最高(圖4A);在pH值5.5、NaCl濃度1.15mol/L下,該酶在15~80℃均有活性,其最適反應(yīng)溫度為70℃(圖4B);在NaCl濃度為1.15mol/L、70℃的反應(yīng)條件下,該酶在pH值4.0~13.0的條件下均有酶活,反應(yīng)最適pH值為7.0(圖4C)。3sity種的鑒定與歸類根據(jù)SYM能在飽和的NaCl濃度下生長,在蒸餾水中裂解和含有明顯的甘油二醚衍生物等特性鑒定該菌株屬于嗜鹽古細(xì)菌。SYM菌株與鹽深紅菌屬相近種和特征種之間生理生化特性比較顯示該菌株屬于鹽深紅菌屬,而且與Halorubrumsodomense種的相似性更高一些。16SrDNA序列同源性分析顯示該菌株也屬于鹽深紅菌屬,而且與Halorubrumdistributum的同源性達(dá)98.23%,根據(jù)嗜鹽菌16SrDNA同源性與種屬鑒定的量化關(guān)系(16SrDNA序列同源性低于98%,可以認(rèn)為同屬不同種,同源性小于95%,可以認(rèn)為屬于不同屬),因此依據(jù)16SrDNA序列分析,SYM種可以歸為Halorubrumdistributum。上述兩種分析方法,在屬水平的歸類上是一致的,但在種的歸類上不一致,其原因是由于上述兩種方法所依賴和相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)是不同的,與生理生化鑒定相關(guān)的基因更多且容易突變,而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是基因的生理功能的體現(xiàn),不是基因序列的體現(xiàn);16SrDNA雖然是遺傳分析比較好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ),但它只是細(xì)菌基因組的一個(gè)片段,不能反映該菌株的所有信息,因此在種的鑒定和歸類上需要在生理生化和基因組分析和比對(duì)方面做進(jìn)一步的工作。目前初步將SYM菌株命名為Halorubrumsp.SYM。Halorubrumsp.SYM具有向培養(yǎng)基中分泌耐鹽、耐堿、耐高溫淀粉酶的特性。關(guān)于酶反應(yīng)條件的初步研究顯示,在反應(yīng)液中NaCl終濃度為2.65mol/L時(shí)淀粉酶活力能保持最高酶活的61%,顯示了該酶強(qiáng)耐鹽性;在不加NaCl時(shí),酶活為最高酶活的75%,顯示了其對(duì)NaCl沒有依賴性,說明Na+對(duì)該淀粉酶的活性有一定的正效應(yīng)。該酶能在廣泛的pH范圍內(nèi)作用,在pH值13.0時(shí),活性為最高酶活的76%,但是其最佳pH值7.0時(shí)的酶活反應(yīng)最好,顯示了其耐堿性及對(duì)pH條件非依賴性