缺氧誘導(dǎo)因子1在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義

缺氧誘導(dǎo)因子1在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義

根據(jù)最近的研究，缺損可能是慢性腎衰竭的一個(gè)共同機(jī)制。許多慢性腎臟病的動(dòng)物模型中均已發(fā)現(xiàn)存在明顯的腎內(nèi)缺氧。因此,英國學(xué)者Fine提出了進(jìn)行性腎損害的可能機(jī)制——“慢性缺氧學(xué)說”。該學(xué)說提出,腎小管間質(zhì)部分的慢性氧缺失是促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展和纖維化的重要原因,體外實(shí)驗(yàn)證明缺氧可刺激腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化,參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展,缺氧主要通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induciblefactor1α,HIF-1α)發(fā)揮作用。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討HIF-1α在慢性腎間質(zhì)纖維化中的作用及六味地黃丸對其表達(dá)的影響。材料和方法1材料表面1.1動(dòng)物SPF級雄性SD大鼠30只,體重180～200g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房。1.2湖南科技第一附屬醫(yī)院六味地黃丸(熟地黃24g,山藥12g,山茱萸12g,澤瀉9g,茯苓9g,牡丹皮9g)購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。先將藥材用相當(dāng)于藥材5倍的自來水浸泡2h煮沸后再微火煎熬30min,過濾后收集煎液,原藥渣加少量水煎煮,取二煎液。將兩煎液混合,于水浴恒溫器上濃縮為每毫升藥液含生藥1g。1.3試驗(yàn)動(dòng)物及試劑一抗為兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1多克隆抗體,美國SantaCruz;兔二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6001)、二抗為山羊抗兔,北京中杉金橋;DAB顯色試劑盒,武漢博士德;ECL化學(xué)發(fā)光試劑,美國Pierce。2方法2.1腎損害內(nèi)固定SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、六味地黃丸組,每組各10只。模型組、六味地黃丸組均在無菌條件下進(jìn)行5/6腎切除術(shù),以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物,常規(guī)消毒鋪巾,從左腹部切口,打開腹腔,靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極(切除2/3),以明膠海綿壓迫止血,復(fù)位腎臟。1周后進(jìn)行第2次手術(shù),切除右側(cè)腎臟。假手術(shù)組采取同樣步驟,打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟,不切除腎臟。右腎摘除術(shù)后第2天,六味地黃丸組予以六味地黃丸灌胃(生藥含量按公式:人的劑量×0.018×5/kg體重計(jì)算),每天1次,至處死為止;模型組、假手術(shù)組以等容積蒸餾水灌胃,給藥8周后全部處死。2.2腎組織病理學(xué)檢測各組大鼠分別于第8周處死,以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物,常規(guī)消毒鋪巾,打開腹腔,結(jié)扎后摘取腎臟。腎組織分為兩部分處理:(1)光鏡觀察:標(biāo)本用4%多聚甲醛固定、4℃保存,按常規(guī)脫水、透明、包埋,石蠟切片3～4μm,分別進(jìn)行HE染色、Masson染色及HIF-1α、PAI-1和TIMP-1免疫組化檢測。(2)腎組織取出后立即放入液氮罐中,隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。2.3腎組織病理學(xué)檢測腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為3～4μm)后,常規(guī)HE染色及Masson染色分析,Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照。2.4免疫二抗鼠抗體pai-1和timp-1免疫組化PV二步法染色,一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1抗體,二抗用相應(yīng)羊抗鼠抗體(工作濃度按產(chǎn)品說明書配制為1∶100或1∶200),染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色。2.5數(shù)碼醫(yī)學(xué)分析Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)分析系統(tǒng)(MoticMed6.0)進(jìn)行圖像分析。觀察視野內(nèi)免疫陽性部分的平均灰度值,半定量法評估,組織細(xì)胞平均灰度值愈小,蛋白表達(dá)愈高。2.6ecl試劑x線顯色法常規(guī)提取蛋白質(zhì)樣品,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每泳道50μg蛋白,10%SDS電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉,加一抗雜交,4℃孵育過夜,洗膜。加相應(yīng)二抗室溫孵育,ECL試劑X線底片上顯色。掃描測定條帶灰度值,以與β-actin的比值作為表達(dá)強(qiáng)度。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1腎組織光度檢查1.1腎組織病理學(xué)檢測假手術(shù)組大鼠腎組織未見明顯病變,腎小球和腎小管大小、形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰,間質(zhì)未見明顯炎細(xì)胞浸潤;模型組腎皮質(zhì)變薄,腎小球系膜細(xì)胞明顯增生,硬化增多,部分腎小管明顯萎縮、消失,部分腎小球發(fā)生代償性肥大,腎小管發(fā)生代償性擴(kuò)張,可見蛋白管型,腎間質(zhì)纖維化明顯,大量淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組相比,六味地黃丸組病理變化明顯減輕,炎細(xì)胞浸潤減少,腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化程度減輕。見圖1。1.2腎間質(zhì)膠原纖維模型組見圖1假手術(shù)組腎小球及腎小管僅基底膜染成藍(lán)色,腎間質(zhì)無明顯膠原纖維;模型組腎間質(zhì)見大量染成藍(lán)色的膠原纖維;六味地黃丸組腎間質(zhì)可見少量膠原纖維。見圖2。2腎組織免疫組化檢測2.1腎皮髓質(zhì)中hoe-1的表達(dá)假手術(shù)組HIF-1α微量表達(dá),主要在腎皮髓質(zhì)交界處,模型組和六味地黃丸組腎小管、間質(zhì)中HIF-1α均表達(dá)增加,而腎小球少有表達(dá)。見圖3。2.2各組pai-1表達(dá)情況PAI-1主要在腎小管表達(dá),尤以近曲小管刷狀緣明顯,腎小球、間質(zhì)少有表達(dá),假手術(shù)組最弱,模型組最強(qiáng),六味地黃丸組PAI-1表達(dá)較模型組明顯降低。見圖4。2.3timp-1表達(dá)TIMP-1主要在腎小管、腎間質(zhì)表達(dá),尤以近曲小管明顯,而腎小球少有表達(dá),假手術(shù)組最弱,模型組最強(qiáng),六味地黃丸組TIMP-1表達(dá)較模型組明顯降低。見圖5。2.4各組大鼠c組,模型組和六味地黃丸組pb腎組織HIF-1α、PAI-1和TIMP-1表達(dá)均以模型組最強(qiáng),六味地黃丸組次之,假手術(shù)組最弱,且模型組和六味地黃丸組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。3兩組患者中機(jī)制地黃丸組對兩組實(shí)證表1表達(dá)持續(xù)抬高與假手術(shù)組比較,模型組和六味地黃丸組HIF-1α表達(dá)持續(xù)上調(diào),且模型組高于六味地黃丸組,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。腎間質(zhì)纖維化缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)是1992年Semenza等在低氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì),是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一一個(gè)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子。大量研究表明,缺氧激活的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α在纖維化發(fā)展中起至關(guān)重要的作用,慢性腎衰竭(chronicrenalfailure,CRF)是各種腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的最終結(jié)局,其主要病理學(xué)特征為慢性腎臟纖維化。慢性缺氧可誘發(fā)HIF-1α持續(xù)表達(dá),后者上調(diào)一系列促纖維化靶基因表達(dá)導(dǎo)致腎臟纖維化。因此,慢性缺氧是引起腎小管間質(zhì)纖維化的一個(gè)關(guān)鍵因素,HIF-1α是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子。5/6腎切除大鼠是目前研究慢性腎臟病進(jìn)展的理想動(dòng)物模型。目前已有研究表明:5/6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動(dòng)脈病變,這種小動(dòng)脈病變可導(dǎo)致腎小球后毛細(xì)血管血流減少和小管間質(zhì)缺血,而缺血就意味著低氧。Manotham等研究證實(shí),在5/6腎切除的大鼠模型中,在發(fā)生小管纖維化前,腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等研究5/6腎切除大鼠模型同樣證實(shí),管周毛細(xì)血管丟失和腎小管間質(zhì)缺氧在腎間質(zhì)纖維化不明顯之前的早期階段(術(shù)后第3周)已經(jīng)很嚴(yán)重,并且持續(xù)存在于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中。Zeng等應(yīng)用5/6腎切除大鼠模型探討缺氧有關(guān)的腎纖維化,發(fā)現(xiàn)HIF-1α在5/6腎切除大鼠腎組織中顯著升高,這一結(jié)果證實(shí)慢性缺氧存在于5/6腎切除模型。俞小芳等研究5/6腎切除大鼠亦發(fā)現(xiàn)在早期階段(術(shù)后第1周末),HIF-1α在腎內(nèi)表達(dá)即開始增加,在術(shù)后12周仍有持續(xù)表達(dá)。本研究顯示:5/6腎切除的大鼠模型中,模型組HIF-1α的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)。Kimura等通過應(yīng)用5/6腎切除的基因敲除小鼠模型證實(shí)了HIF-1α在腎纖維化中的作用,認(rèn)為抑制HIF-1α的表達(dá)是治療腎臟纖維化的靶點(diǎn)。正常的情況下,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的生成和降解保持動(dòng)態(tài)平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細(xì)胞浸潤時(shí),纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物(PAs/PAIs)和基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)的表達(dá)失衡,致使ECM合成增多,降解減少,使大量ECM沉積于腎間質(zhì),形成纖維化。因此,PAI-1和TIMP-1表達(dá)升高均可造成ECM的降解減少,從而導(dǎo)致ECM的積聚,這是引起腎間質(zhì)纖維化的重要原因,已有實(shí)驗(yàn)證明,HIF-1α可上調(diào)PAI-1和TIMP-1的表達(dá)。六味地黃丸始見于宋·錢乙的《小兒藥證直訣·卷下諸方》,以張仲景《金匱要略》的腎氣丸減桂枝、附子,易干地黃為熟地黃而成。六味地黃丸是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑,其臨床運(yùn)用廣泛,且療效肯定,然其作用機(jī)制尚不明了,前期研究已證實(shí):5/6腎切除大鼠在手術(shù)后8周,留存腎不可避免地發(fā)生了間質(zhì)纖維化;給5/6腎切除大鼠灌胃六味地黃丸8周后,其血清尿素氮、肌酐的水平明顯低于模型組,并能減少留存腎系膜細(xì)胞的增生及間質(zhì)纖維化,使腎切除大鼠生存期延長。六味地黃丸具有改善5/6腎切除大鼠殘腎腎功能的作用,其改善殘腎腎功能的作用與六味地黃丸提高腎小球的體積密切相關(guān)。在本研究