-第七章-生物反應器-細胞培養(yǎng)

發(fā)酵機械與設備徐明芳博士教授暨南大學生科院2015-11-13目錄緒論第一篇生物質(zhì)原料處理設備第二篇生物反應設備第三篇產(chǎn)物分離設備第四篇其他設備底物生物反應器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經(jīng)加工原料酶細胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品產(chǎn)品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術過程核心技術？第一篇生物質(zhì)原料處理設備第一章生物質(zhì)原料預處理設備第二章生物細胞培養(yǎng)基制備設備第三章生物培養(yǎng)基滅菌設備第四章原料（物料）輸送設備第二篇生物反應設備第一節(jié)發(fā)酵設備概述第二節(jié)通風發(fā)酵罐結構與工作原理第三節(jié)自吸式發(fā)酵罐結構與工作原理第四節(jié)氣升式發(fā)酵罐(ALR)結構與工作原理第五章生物反應器—通風攪拌發(fā)酵罐第六章厭氧（嫌氣）發(fā)酵設備

第一節(jié)

酒精發(fā)酵設備第二節(jié)啤酒發(fā)酵設備第三節(jié)連續(xù)發(fā)酵設備第二篇生物反應設備第七章生物反應器—細胞培養(yǎng)反應器第一節(jié)植物細胞反應器第二節(jié)動物細胞反應器第三節(jié)微藻培養(yǎng)反應器第六章厭氧（嫌氣）發(fā)酵設備第五章生物反應器—通風攪拌發(fā)酵罐底物生物反應器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經(jīng)加工原料酶細胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品產(chǎn)品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術過程核心技術？思考題1、有幾種植物細胞（組織）培養(yǎng)的類型與特點2、簡述植物體細胞雜交培養(yǎng)的過程3、植物細胞培養(yǎng)與微生物的區(qū)別？4、常用的植物生物反應器有哪些？那種反應器更適合植物細胞培養(yǎng)，具有什么優(yōu)缺點？5、舉例說明植物細胞培養(yǎng)的流程與應用6、植物細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)需解決的難題7、有哪兩種動物細胞培養(yǎng)方法？其特點？8、動物細胞培養(yǎng)可生產(chǎn)的生物制品？9、動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品工藝實例10、動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)的特點有什么差異性11常用的動物生物反應器有哪些？12常用的藻類生物反應器有哪些？

植物細胞培養(yǎng)技術包括植物器官（根、枝葉、發(fā)根、胚和冠癭組織等）、組織、細胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)，并以此發(fā)展起來的各種植物細胞培養(yǎng)技術。第一節(jié)植物細胞培養(yǎng)第一節(jié)植物細胞（組織）培養(yǎng)反應器

1植物細胞（組織）培養(yǎng)

2植物細胞培養(yǎng)反應器

3植物組織培養(yǎng)反應器GottleibHaberlandt

1902年德國植物學家Haberlandt在營養(yǎng)液中成功地培育了單個植物細胞，盡管未能使其分裂生長，但為植物細胞培養(yǎng)翻開了新的一頁。

Haberlandt提出植物細胞的“全能性”學說，植物細胞的全能性：植物的體細胞具有母體植株全部遺傳信息并發(fā)育成為完整個體的潛力，因而每一個植物細胞可以像胚胎細胞那樣，經(jīng)離體培養(yǎng)再生成植株。

一般采用植物的體細胞(二倍體細胞)，先經(jīng)纖維素酶處理去掉細胞壁(原生質(zhì)體)。將原生質(zhì)體放在合適的培養(yǎng)基上，經(jīng)過誘導分化可以重新長成植株。原生質(zhì)體也可用于植物細胞融合，然后誘導形成新的植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物細胞（組織）培養(yǎng)---(1)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物細胞（組織）培養(yǎng)---(2)植物組織培養(yǎng)(planttissueculture)植物組織培養(yǎng)：離體的植物器官、組織、細胞植物體愈傷組織脫分化根芽再分化脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化。再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細胞的再分化。植物組織培養(yǎng)(1)(1)(3)1植物細胞（組織）培養(yǎng)---(3)植物體細胞雜交(5)植物A細胞植物B細胞去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合融合體再生壁雜種細胞細胞分裂愈傷組織雜種植株(2)(4)植物細胞培養(yǎng)與微生物的區(qū)別：細胞的大小—大細胞塊的形狀—易成快培養(yǎng)液的黏度-需氧量

Kla

值比微生物培養(yǎng)的Kla值小得多對剪切力敏感需CO2和光照2植物細胞培養(yǎng)(plantcellculture)

植物細胞培養(yǎng)具有的優(yōu)點：（1）代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)完全在人工控制條件下進行，可以通過改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系得到超整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；（2）培養(yǎng)在無菌條件下進行，可排除病菌和蟲害侵擾；（3）可以進行特定的生物轉化反應；（4）可以探索新的合成路線和獲得新的有用物質(zhì)等。2植物細胞培養(yǎng)(plantcellculture)2植物細胞培養(yǎng)反應器StirredTankBioreactors2植物細胞培養(yǎng)反應器（1）機械攪拌式反應器優(yōu)點：混合性能好傳氧效率高操作彈性大可用于細胞高密度培養(yǎng)；缺點：剪切力大。

懸浮培養(yǎng)生物反應器盡管機械攪拌反應器已成功用于許多細胞的培養(yǎng)中，反應器內(nèi)的溫度、pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度較其他反應器更易控制等優(yōu)點，但由于機械攪拌造成的剪切力以對植物細胞造成較大的損傷，對次級代謝產(chǎn)物的合成也會產(chǎn)生影響，同時會帶來染菌和機械上的問題，因此需篩選出抗剪切力的細胞系，也可對反應器結構進行改造，尤其是攪拌槳的結構和類型的改進，使其具有緩和、充分的攪拌效果。圖示目前規(guī)模最大的植物細胞培養(yǎng)反應器裝置2植物細胞培養(yǎng)反應器

機械攪拌式反應器機械攪拌通風式生物反應器非攪拌式反應器所產(chǎn)生的剪切力較小，結構簡單。其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器等氣體攪拌式反應器

2植物細胞培養(yǎng)反應器

（2）非機械攪拌式反應器---氣升式BubbleColumnBioreactor植物細胞培養(yǎng)反應器

非機械攪拌式反應器Air-liftBioreactor植物細胞的培養(yǎng)比較多地采用各種非機械攪拌生物反應器，其中常用的是氣體攪拌生物反應器。氣體攪拌生物反應器沒有活動的攪拌裝置，在很大程度上減少了剪切力，并能在長期操作中保持無菌。氣體攪拌生物反應器包括鼓泡塔和氣升式反應器等。氣體攪拌生物反應器結構較簡單，氧傳遞效率高，剪切力低，對細胞的損傷小，容易實現(xiàn)長期無菌培養(yǎng)，較適用于植物細胞培養(yǎng)。缺點：操作彈性小，低氣速時尤其在培養(yǎng)后期細胞密度較高時，混合效果較差。如果提高通氣量，又會產(chǎn)生大量泡沫，也易于驅(qū)除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對細胞生長有阻礙作用。過高的溶氧對植物細胞合成次級代謝產(chǎn)物不利。植物細胞培養(yǎng)反應器紫草細胞培養(yǎng)紫草種子無菌幼根LS培養(yǎng)基愈傷組織誘導培養(yǎng)懸浮細胞懸浮培養(yǎng)細胞增殖培養(yǎng)一級培養(yǎng)利用“優(yōu)勢互補”原則，將兩種反應器結合起來研究出組合式反應器。帶有低速攪拌的氣升式發(fā)酵罐可彌補低氣速時混合性差的弱點。植物細胞培養(yǎng)反應器

（3）組合式反應器光生物反應器植物細胞培養(yǎng)反應器

固定化細胞生物反應器

（4）填充床反應器（5）流化床反應器細胞可以位于支撐物表面，也可包埋于支撐物之中，培養(yǎng)液流經(jīng)支撐物顆粒，不斷被細胞利用。優(yōu)點：單位體積固定細胞量大。缺點：混合效果低，對必要的氧傳遞、pH、溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成困難，影響細胞的培養(yǎng)。利用液體的能量來懸浮顆粒。顆粒呈流化狀態(tài)所需的能量與顆粒大小成正比，因此常采用小固定化顆粒，這些小顆粒良好的傳質(zhì)特性是流化床反應器的優(yōu)點，缺點：剪切力和顆粒碰撞會損壞固定化細胞。植物細胞培養(yǎng)反應器

流化床反應器植物細胞培養(yǎng)反應器

流化床反應器植物細胞培養(yǎng)反應器

（6）固定化細胞膜反應器中空纖維螺旋卷繞反應器采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細胞。營養(yǎng)物質(zhì)通過膜滲透到細胞中，細胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中。主要有：中空纖維反應器和螺線式卷繞反應器，優(yōu)點：可以重復使用3植物組織培養(yǎng)反應器

發(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)反應器

(1).小植物的大規(guī)?？焖俜敝?/p>

淺層循環(huán)式植株快速繁殖器

雙層板徑向流生物反應器植物組織培養(yǎng)反應器

小植物的大規(guī)?？焖俜敝?/p>

內(nèi)環(huán)噴霧生物反應器4植物細胞培養(yǎng)的應用（1)西洋參細胞培養(yǎng)無菌根愈傷組織懸浮細胞發(fā)酵液乙醇消毒誘導培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)大量培養(yǎng)西洋參根細胞過濾西洋參細胞干粉成品干燥植物細胞的生產(chǎn)流程與應用

(2)藥物的生產(chǎn)植物細胞產(chǎn)物產(chǎn)物作用紫草細胞紫草寧抗炎劑、食用色素苦瓜細胞類胰島素治療糖尿病長春花細胞長春花堿治療白血病藥紅豆杉細胞紫杉醇抗癌藥物毛地黃細胞毛地黃毒素強心劑紫草種子無菌幼根愈傷組織懸浮細胞細胞增殖培養(yǎng)LS培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)一級培養(yǎng)產(chǎn)物培養(yǎng)二級培養(yǎng)發(fā)酵液細胞收集過濾產(chǎn)物提取分離成品干燥紫草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧(Shikonin)植物細胞培養(yǎng)的應用(3)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)植物細胞培養(yǎng)的應用

植物細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)需解決的難題

縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本提高培養(yǎng)細胞中的有效成分含量防止細胞集聚成塊防止細胞株的種性退化和變異研制更能適合植物細胞生長的生物反應器第二節(jié)動物細胞融合1、動物細胞培養(yǎng)將動物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和繁殖。根據(jù)生物反應器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)用生物反應器等。種類上大致有塑料袋增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋膜增殖器、槳式攪拌反應器、棒式攪拌反應器、船舶推進槳攪拌反應器、傾斜槳葉攪拌反應器、船帆形攪拌反應器、往復振動錐孔篩板攪拌反應器、籠式通氣攪拌反應器、雙層籠式通氣攪拌反應器、空氣提升式反應器等。表５－１示為某些生物反應器的主要特性。雜交瘤技術動物細胞培養(yǎng)反應器

1動物細胞培養(yǎng)方法

2動物細胞培養(yǎng)技術的應用

3動物細胞培養(yǎng)的特點

4細胞培養(yǎng)的操作方式

5細胞培養(yǎng)反應器體外培養(yǎng)的動物細胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長。大多數(shù)動物細胞屬于貼壁型細胞，如Hela、Vero、BHK、CHO細胞系。懸浮型細胞在培養(yǎng)中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞和某些轉化細胞。1動物細胞培養(yǎng)方法1動物細胞培養(yǎng)方法（1）貼壁培養(yǎng)(單層細胞培養(yǎng))

分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時)就貼附在瓶壁上，

稱為細胞貼壁，

貼壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)性，

呈單層生長，

所以此法又叫單層細胞培養(yǎng)。（2）懸浮培養(yǎng)

細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程，不貼壁，主要用于懸浮型細胞培養(yǎng)，如淋巴細和腫瘤細胞的培養(yǎng)。（3）固定化培養(yǎng)

一種包埋培養(yǎng)。對兩類細胞都適用，細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強。懸浮型細胞常用海藻酸鈣包埋，貼壁型細胞常用膠原包埋。1動物細胞培養(yǎng)方法動物細胞培養(yǎng)可生產(chǎn)的生物制品1.病毒疫苗：口蹄疫(FMD)、狂犬疫苗等2.非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素(IFN)、白介素(IL)等3.多肽生長因子：神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)4.酶：組織血纖維溶酶原激活劑(t-PA)5.激素：紅細胞生成素(EPO)、促黃體生成素(LH)6.病毒殺蟲劑7.腫瘤特異性抗原：癌胚抗原(CEA)8.單克隆抗體9.皮膚重植10.細胞2動物細胞培養(yǎng)技術的應用2動物細胞培養(yǎng)技術的應用

動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品工藝實例

1.組織纖溶酶激活劑生產(chǎn)工藝流程細胞單層細胞懸液細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)培養(yǎng)液提取液

層析液濃縮液層析液tPA成品分散分離提取層析純化濃縮層析精制凍干2.抗HBsAS的單克隆抗體生產(chǎn)工藝流程培養(yǎng)液雜種細胞混合物大鼠骨髓瘤＋免疫大鼠脾淋巴細胞融合融合混合物篩選克隆化雜交瘤克隆系種質(zhì)培養(yǎng)細胞種質(zhì)擴大培養(yǎng)分離粗制McAb精制層析液超慮濃縮液凍干McAb精品雜交瘤技術動物細胞培養(yǎng)的特點1.細胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素；2.動物細胞較微生物大得多，無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力差；3.培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強力通風與攪拌；4.在機體中，細胞相互粘連以集群形式存在；5.培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細胞內(nèi)外，成本高，產(chǎn)品價格昂貴；6.大規(guī)模培養(yǎng)時，不可套用微生物反應的經(jīng)驗；7.原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡。3動物細胞培養(yǎng)的特點動物細胞培養(yǎng)反應器無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，深層培養(yǎng)的操作方式可分4細胞培養(yǎng)的操作方式分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式。分批式操作操作簡單、是最常用的操作方式。分批式培養(yǎng)過程中，細胞的生長可分為延遲期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期分批式培養(yǎng)細胞生長曲線流加式操作

半連續(xù)式操作4細胞培養(yǎng)的操作方式能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。

連續(xù)操作能提高細胞密度，應用于培養(yǎng)懸浮型細胞。

灌注培養(yǎng)大大提高細胞密度，有助于產(chǎn)物的表達和純化。5動物細胞培養(yǎng)反應器動物細胞培養(yǎng)反應器它是根據(jù)動物細胞培養(yǎng)時要求剪切力小、混合性能好的特點開發(fā)出來的生物反應器。主要有Spier籠式通氣攪拌生物反應器、CelliGen籠式通氣攪拌生物反應器和CellCul-20雙層籠式通氣攪拌生物反應器動物細胞培養(yǎng)反應器通氣攪拌式細胞培養(yǎng)反應器動物細胞培養(yǎng)反應器

通氣攪拌式細胞培養(yǎng)反應器１Spier籠式通氣攪拌生物反應器

特點可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時氣泡直接損傷細胞；在采用微載體系培養(yǎng)時，微載體不會被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫囊夾在氣液界面；通過一個多孔的通氣裝置在籠內(nèi)通氣以滿足培養(yǎng)時溶氧的需要。在鼓泡通氣過程中所采用的泡沫經(jīng)管道進入液面上部的由不銹鋼絲網(wǎng)制