第五章 微生物的生長和環(huán)境條件

微生物培養(yǎng)的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌體為目標(biāo)（如單細(xì)胞蛋白或胞內(nèi)產(chǎn)物），有些則是希望在微生物生長的同時，實現(xiàn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的大量積累。由于培養(yǎng)目標(biāo)的不同，在培養(yǎng)方法上也就存在許多差別。微生物的培養(yǎng)方法從歷史發(fā)展的角度來看，微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展主要有以下特點：①從少量培養(yǎng)發(fā)展到大規(guī)模培養(yǎng)；②從淺盤培養(yǎng)發(fā)展到厚層固體或深層（液體）培養(yǎng)；③從以固體培養(yǎng)為主發(fā)展到以液體培養(yǎng)為主；④從靜止式液體培養(yǎng)發(fā)展到通氣攪拌式液體培養(yǎng)；⑤從分批培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以至多級連續(xù)培養(yǎng)；⑥從游離的微生物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展到利用固定化細(xì)胞培養(yǎng)；⑦從單一微生物培養(yǎng)發(fā)展到混合微生物培養(yǎng)；⑧從利用野生菌種發(fā)展到利用變異菌株以及“工程菌”。一、投料方式1、分批培養(yǎng)2、連續(xù)培養(yǎng)3、補(bǔ)料分批培養(yǎng)二、培養(yǎng)狀態(tài)1、固體培養(yǎng)2、液體培養(yǎng)三、氧氣1、厭氧2、好氧四、菌種的數(shù)量1、純種培養(yǎng)2、混菌培養(yǎng)根據(jù)微生物種類、培養(yǎng)目的和要求、規(guī)模和資金投入的不同可以有不同形式的培養(yǎng)裝置。一、投料方式1、分批培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、霉菌的生長曲線一次性投料，一次性收獲延滯期少量細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基后，一般不立即進(jìn)行繁殖，生長速度近于零。因此在開始一段時間，細(xì)菌數(shù)幾乎保持不變，甚至稍有減少。這段時間被稱為延遲期，又稱為遲緩期、調(diào)整期或滯留適應(yīng)期。（1）延滯期出現(xiàn)原因（2）延滯的特點（3）影響延滯期限長短的因素（4）縮短延滯期的意義及方法A、微生物接種到一個新的環(huán)境，暫缺乏足夠的能量和必需的生長因子；B、“種子”老化（即處于非對數(shù)生長期）或未充分活化。C、接種時造成的損傷（1）延滯期出現(xiàn)原因（2）延滯期的特點特點：1）生長速率常數(shù)為零；2）細(xì)胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀。.細(xì)菌數(shù)量不增加或增加很少，代謝活躍；3）細(xì)胞內(nèi)RNA，尤其是rRNA的含量很高，細(xì)胞的嗜堿性強(qiáng)；4）合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶5）對外界不良條件如NaCl溶液、溫度和抗生素等理、理化因素反應(yīng)敏感。（3）影響延滯期時間長短的因素B、接種齡:以對數(shù)期接種齡的種子接種，延滯期短C、接種量:發(fā)酵工業(yè)上通常采用種子：發(fā)酵培養(yǎng)基=1：10D、培養(yǎng)基成分:一般要求發(fā)酵培養(yǎng)基的成分或種子培養(yǎng)基的成分盡量接近，且應(yīng)適當(dāng)豐富些。A、菌種特性（4）縮短延滯期的意義及方法（1）意義：

可以縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率（2）縮短延滯期的方法A、通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短B、接種對數(shù)生長期的菌種，采用最適菌齡C、盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大D、加大接種量指數(shù)期

對數(shù)期又稱指數(shù)期。這一階段突出特點是細(xì)菌數(shù)以幾何級數(shù)增加，代時穩(wěn)定，細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性。特點1）生長速率常數(shù)R最大代時最短，生長速度最快；2）細(xì)胞穩(wěn)定（平衡）生長：細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)按比例生長，菌體成分均勻；3）酶系活躍，代謝旺盛。穩(wěn)定期（1）出現(xiàn)原因A、營養(yǎng)的消耗C、引起pH值EH值的改變D、有害代謝產(chǎn)物積累B、營養(yǎng)物的比例失調(diào)（2）特點：1）生長常數(shù)為零，新生=死亡，達(dá)到動態(tài)平衡；2）活菌數(shù)的總量達(dá)到最大值；3）胞內(nèi)的儲藏物開始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；4）某些芽孢菌的芽孢開始形成；5）某些細(xì)菌過量積累次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、維生素等。衰亡期

特點：1）細(xì)菌代謝活性降低；

2）細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶；

3）產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物；如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。

4）菌體細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊；有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌此時會變成陰性反應(yīng)2、連續(xù)培養(yǎng)是在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)下去的一種培養(yǎng)方法?；驹瓌t：在微生物培養(yǎng)過程中不斷的補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物。連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點：1、高效2、產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定3、節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，且使水、氣、電的負(fù)荷均衡合理。缺點：1、菌種易退化2、易污染雜菌3、營養(yǎng)物的利用率一般低于單批增大。恒化器：與恒濁器相反，是一種設(shè)法使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。恒濁器：根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，以取得菌體密度高，生長速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。恒濁器與恒化器的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長因子不恒定最高速率大量菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高速率不同生長速率的菌體實驗室為主固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞固定化就是通過包埋法、微膠囊化、吸附法等手段，將微生物細(xì)胞限制在載體的內(nèi)部或表面。固定化細(xì)胞培養(yǎng)與游離細(xì)胞培養(yǎng)相比，有以下一些優(yōu)勢：①固定化可提供較高的細(xì)胞密度；②固定化減少了細(xì)胞的流失，使細(xì)胞可以反復(fù)利用；③固定化可以提供對細(xì)胞有利的微環(huán)境；④可以保護(hù)某些細(xì)胞免受剪切損傷；⑤簡化了下游的細(xì)胞分離步驟。固定化載體常常易碎，且固定的細(xì)胞容易脫落等原因的存在，固定化細(xì)胞培養(yǎng)器中的剪切力也不宜過高，一般采用填充柱、流動床或氣升式反應(yīng)器。機(jī)械攪拌式反應(yīng)器只適用于載體牢固、不易脫落的固定化細(xì)胞。通常是將固定化細(xì)胞裝在反應(yīng)器內(nèi)，一端流入培養(yǎng)基，另一端放出發(fā)酵液，而固定化微生物細(xì)胞始終停留在反應(yīng)器內(nèi)。3、補(bǔ)料分批發(fā)酵在生產(chǎn)實踐中．完全封閉式的分批培養(yǎng)或純粹的連續(xù)培養(yǎng)較為少見，更多見的是兩者的折中形式——補(bǔ)料分批或流加發(fā)酵。

補(bǔ)料發(fā)酵是根據(jù)菌株生長和初始培養(yǎng)基的特點，在分批培養(yǎng)的某些階段適當(dāng)補(bǔ)加部分配料成分或碳源，以提高菌體或代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。流加營養(yǎng)：水解糖（葡萄糖）、氨水補(bǔ)料分批發(fā)酵的特點有：1）可以減弱底物和代謝產(chǎn)物的抑制。微生物的生長會受到高濃度底物和逐步過量產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的抑制，若將初始底物濃度降低，就會限制菌體密度和產(chǎn)物濃度的提高。但采用間歇補(bǔ)料．通過不斷的流加限制性底物就可克服該缺點?？梢员苊馄咸烟切?yīng)對微生物生長和產(chǎn)物積累的影響。流加補(bǔ)料還可稀釋降低代謝產(chǎn)物的濃度，減輕其抑制生長作用。

2）增加次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。次級代謝產(chǎn)物的合成常常在生長平衡期才開始合成，與穩(wěn)定期的細(xì)胞密度和延續(xù)時間密切相關(guān)。但間歇發(fā)酵的平衡期比較短，因營養(yǎng)物質(zhì)已大量消耗．可同化量很少．很快就進(jìn)入衰亡期。通過補(bǔ)料可延長平衡期．增加次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。3）可以提高發(fā)酵的細(xì)胞密度。補(bǔ)料發(fā)酵時不斷地向發(fā)酵罐補(bǔ)償限制性底物，微生物始終能獲得充分的營養(yǎng)，菌體密度就可以增加，合理改進(jìn)發(fā)酵工藝．細(xì)胞密度可以達(dá)到10％以上干細(xì)胞，大大提高產(chǎn)率。

4）可以恒定培養(yǎng)條件。發(fā)酵過程中的培養(yǎng)環(huán)境會隨著代謝作用的進(jìn)行而變化，如培養(yǎng)基的pH值，這時可流加氨水或通氨來恒定pH值．還補(bǔ)充氮源。二、培養(yǎng)狀態(tài)1、固體培養(yǎng)2、液體培養(yǎng)1、固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)就是利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的繁殖。固體培養(yǎng)在微生物鑒定、計數(shù)、純化和保藏等方面發(fā)揮著重要作用。一些絲狀真菌可以進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模的固體發(fā)酵。實驗室常見的固體培養(yǎng)試管斜面、培養(yǎng)皿平板、較大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面。用于菌種的分離、純化、保藏和生產(chǎn)種子的制備。（1）用接種環(huán)挑取原始培養(yǎng)物后，在固體培養(yǎng)基表面劃線接種（2）用涂布棒將少量的液體培養(yǎng)物涂布在整個固體培養(yǎng)基表面（3）將少量液體培養(yǎng)物與融化后降溫至50～60度的固體培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿中，澆注成平板。接種后的培養(yǎng)物直接放入培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。這些方法適用于好氧和兼性好氧微生物的培養(yǎng)。微好氧微生物采取穿刺培養(yǎng)對厭氧菌培養(yǎng)必需創(chuàng)造更嚴(yán)格的無氧環(huán)境厭氧培養(yǎng)皿。厭氧罐，Hungate滾管技術(shù)生產(chǎn)中常見的固體培養(yǎng)

在生產(chǎn)實踐中，好氧真菌的固體培養(yǎng)方法都是將接種后的固體基質(zhì)薄薄地攤鋪在容器的表面，可使菌體獲得充足的氧氣，又可以將生長過程中產(chǎn)生的熱量及時釋放。固體培養(yǎng)使用的基本培養(yǎng)基原料是小麥麩皮等。滅菌后待冷卻到合適溫度便可接種。固體培養(yǎng)基中的含水量控制在40％～80％之間（典型的液體培養(yǎng)基含水量在95％以上），細(xì)菌和酵母菌將無法忍