第八講 蛋白質(zhì)的1-4級結(jié)構(gòu)

第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)第三節(jié)蛋白質(zhì)功能第四節(jié)蛋白質(zhì)性質(zhì)與生化分析

蛋白質(zhì)的化學(xué)10/18/20231氨基酸的結(jié)構(gòu)通式羧基氨基10/18/20232非極性氨基酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸丙氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸纈氨酸色氨酸異亮氨酸10/18/20233極性不帶電荷氨基酸絲氨酸蘇氨酸天冬酰胺谷氨酰胺酪氨酸半胱氨酸10/18/20234帶負(fù)電荷氨基酸天冬氨酸谷氨酸10/18/20235帶正電荷氨基酸賴氨酸精氨酸組氨酸10/18/20236蛋白質(zhì)的1-4級結(jié)構(gòu)層次氨基酸是如何形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的？10/18/20237第二節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)----多肽鏈10/18/20238一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。一、多肽與肽鍵的形成10/18/20239肽鍵N=C0.127nm鍵長=0.132nmN-C

0.148nm肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。10/18/202310肽平面或酰胺平面：組成肽單位的4個原子和2個相鄰的α碳原子都處于同一個平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱為肽平面或酰胺平面。肽單位：實際就是一個肽平面二.肽單位

肽鍵的四個原子和與之相連的兩個α-碳原子所組成的基團(tuán)。10/18/202311

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角酰胺平面與α-碳原子之間形成的二面角（φ和ψ）10/18/202312三、肽鏈中AA的排列順序和命名通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如下面的五肽可表示為：

Ser-Gly-Tyr-Val-Leu10/18/202313肽鍵和肽的結(jié)構(gòu)如圖所示絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸10/18/202314

多肽鏈結(jié)構(gòu)示意圖10/18/202315四、天然存在的活性肽自然界中有自由存在的活性肽，主要有：1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu—Cys—Gly），含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。分子中具有一個由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的

-氨基脫水縮合的-肽鍵10/18/2023162.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用，它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成，是體內(nèi)自己產(chǎn)生的一類鴉片劑。10/18/2023173.牛催產(chǎn)素與加壓素：

均為九肽，分子中含有一對二硫鍵，兩者結(jié)構(gòu)類似。前者第八位為Leu，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進(jìn)分娩。后者可促進(jìn)小動脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)節(jié)。

牛催產(chǎn)素SS Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2

牛加壓素SS Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Arg·Gly-NH210/18/202318定義——1969年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定：

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。

2.一級結(jié)構(gòu)的意義五.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)10/18/20231910/18/202320

3.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定（1）.測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的要求：a、樣品必須是均一的，純度應(yīng)在97%以上；b、知道蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其誤差允許在10%左右；10/18/20232110/18/202322（2）.測定一級結(jié)構(gòu)的基本原理和方法基本策略：

氨基酸順序直測法＋片段重疊法技術(shù)路線：10/18/202323將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)基本方法路線：10/18/202324①測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)相對分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。②拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵10/18/202325胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。10/18/202326③

分析每一條多肽鏈的氨基酸組成經(jīng)分離、純化的多肽鏈一部分樣品進(jìn)行完全水解，測定它的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。④

鑒定多肽鏈N－末端、C－末端氨基酸殘基

Sanger法（二硝基氟苯反應(yīng)）DNS法（丹磺酰氯反應(yīng)）

Edman法（異硫氰酸苯脂反應(yīng)）氨肽酶法肼解法羧肽酶法

LiBH4還原法N端C端10/18/202327+DNFB（dinitrofiuorobenzene）氨基酸弱堿中DNP-AA(黃色)1.（sanger反應(yīng)）+HF二硝基氟苯10/18/202328Sanger法DNFB

（二硝基氟苯）反應(yīng)黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進(jìn)行鑒定10/18/20232910/18/2023302.丹磺酰氯反應(yīng)（DNS）+HCI有熒光丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱10/18/202331（DNS法）丹磺酰氯反應(yīng)-HCl+氨基酸混合物水解多肽多肽DNS-氨基酸具有熒光10/18/202332+PITC弱堿中(400C)苯硫乙內(nèi)酰脲(PTH-AA)(無水氫氟酸中)H+苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）3.（Edman反應(yīng)）10/18/202333Edman法（異硫氰酸苯脂反應(yīng)）PITC用層析法分離10/18/20233410/18/202335酶解法：如胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶化學(xué)法：如溴化氰法羥胺法⑤裂解多肽鏈成較小的片段10/18/202336胰蛋白酶R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。10/18/202337糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。10/18/202338胃蛋白酶R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑10/18/202339嗜熱菌蛋白酶R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly

水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。10/18/202340⑥測定各肽段的氨基酸序列

基本方法：Sanger法

Edman降解法

DNS-Edman測序法

蛋白質(zhì)順序儀測序10/18/202341PTC肽Edman降解法為例10/18/202342環(huán)化裂解ATZ-AA噻唑呤酮苯氨10/18/202343PTH轉(zhuǎn)換10/18/202344⑦

片段重疊法重建完整多肽鏈一級結(jié)構(gòu)

所得資料：

氨基末端殘基H羧基末端殘基S第一套肽段第二套肽段

OUS

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PS

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HO10/18/202345末端殘基HS末端肽段HOWT

APS第一套肽段HOWT

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PS第二套肽段HO

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APS

推斷全順序HOWTOUSEOVERLAPS

借助重疊法確定肽段次序：10/18/202346⑧確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的順序測定完成后，將未拆開二硫鍵的同一種蛋白質(zhì)再一次進(jìn)行專一性的酶解，由此就可以確定完整的蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置。10/18/202347確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。酶降解分離測定10/18/202348對角線電泳：

把水解的混合肽段點到濾紙中央，在pH6.5的條件下，進(jìn)行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來。然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S-斷裂。這時每個含二硫鍵的肽段被氧化成一對含半胱氨磺酸的肽。濾紙旋轉(zhuǎn)90度角在與第一向完全相同的條件下進(jìn)行第二向電泳。在這里，大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段比原來含二硫鍵的肽小而負(fù)電荷增加，結(jié)果它們都偏離了對角線。肽斑可用茚三酮顯色確定。10/18/202349+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段二硫鍵位置的確定10/18/202350蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)10/18/202351肽平面或酰胺平面：10/18/202352蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的主鏈本身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構(gòu)象.它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。(注:二級結(jié)構(gòu)不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象)主要有

-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。一.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定義10/18/202353氫鍵：

x—H…y

疏水作用力：是指非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的集合力

范德華力：在物質(zhì)的聚集狀態(tài)中，分子與分子之間存在著一種較弱的作用力

離子鍵：它是由帶相反電荷的兩個基團(tuán)間的靜電吸引所形成的

二硫鍵：是兩個硫原子之間所形成的共價鍵二.蛋白質(zhì)的各種二級結(jié)構(gòu)10/18/202354多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm;

每個aa殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100度.肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)中的

-螺旋幾乎都是右手螺旋。

-螺旋都是由L-型氨基酸構(gòu)成的（Gly除外）。1.-螺旋及結(jié)構(gòu)特點

-螺旋10/18/20235510/18/20235610/18/202357螺距0.54nm每殘基的軸向高度0.15nm每殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100o10/18/2023582.α-螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素:凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H,不可能形成氫鍵。靜電斥力。若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰,則因pH=7.0時都帶負(fù)電荷,防礙α螺旋的形成;同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi),正電荷相斥,也防礙α螺旋的形成?？臻g位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙α螺旋的形成。10/18/202359

-折疊（-sheet）

-折疊或

-折疊片也稱

-結(jié)構(gòu)或

-構(gòu)象，它