亞硫酸鹽處理木質(zhì)纖維素產(chǎn)生的廢液中生物抑制劑的快速測定

亞硫酸鹽處理木質(zhì)纖維素產(chǎn)生的廢液中生物抑制劑的快速測定

由于木材纖維的原料制備的燃料乙醇通常需要預(yù)處理、酶分解和發(fā)酵，其中預(yù)處理是提高纖維素酶分解效率的一項(xiàng)重要技術(shù)。酸性亞硫酸鹽預(yù)處理因具有纖維素水解率和得率高、木素易回收利用等特點(diǎn),近年來受到廣泛的關(guān)注。酸性亞硫酸鹽過程中,木素經(jīng)磺化、降解等反應(yīng)后,主要以木素磺酸鹽的形式溶解于廢液中;部分半纖維素水解成單糖后,進(jìn)一步降解成糠醛和羥甲基糠醛(HMF)。這些副產(chǎn)物能抑制酶的活性或微生物的生長,因而被稱為“生物抑制劑”。監(jiān)測生物抑制劑的生成對(duì)預(yù)處理的優(yōu)化控制具有重要意義。已有報(bào)道UV光譜法可同步測定木素和糠醛類物質(zhì),但由于這些物質(zhì)對(duì)紫外光有強(qiáng)烈吸收,該法需要對(duì)試樣進(jìn)行稀釋。衰減全反射(ATR)-UV光譜法可對(duì)試樣進(jìn)行直接測定而無需稀釋,已用于同步檢測硫酸鹽制漿廢液中的硫化物、有效堿、可溶解木素和總?cè)芙庑怨绦挝?。本文建立了同步測定木素磺酸鹽、糠醛和HMF的ATR-UV光譜分析法,并將其應(yīng)用于桉木亞硫酸鹽廢液的分析。1實(shí)驗(yàn)1.1桉木亞硫酸鹽廢液的制備桉木木片由廣東省雷州市林業(yè)局提供。經(jīng)篩選后,木片的規(guī)格為長15～30cm,寬15～20mm,厚3～5mm。在使用前,密封保存在-18℃的冰柜中。木素磺酸鹽是用超濾法從桉木亞硫酸氫鈉預(yù)處理廢液中純化而得。預(yù)處理?xiàng)l件為:NaHSO3用量3%(w/w),H2SO4用量0.2%(v/v),最高溫度170℃,保溫時(shí)間30min,液比3∶1。預(yù)處理完成后,使用NaOH溶液調(diào)節(jié)桉木亞硫酸鹽廢液的pH值至5～6并過濾。然后將濾液稀釋10倍,泵送入Millipore超濾系統(tǒng)(Amicon,US)。收集截留分子量10～50ku的級(jí)分,并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至濃度80g/L以上。使用液氮對(duì)濃縮液進(jìn)行急凍,然后再冷凍干燥至水分低于0.5%?？啡┖土u甲基糠醛均為購自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)的分析純?cè)噭?。其他試劑均購自廣州化學(xué)試劑廠。1.2hso4密度用于建立光譜分析方法而進(jìn)行的預(yù)處理?xiàng)l件為:NaHSO3用量4%(w/w),H2SO4(濃度98%,密度1.84g/mL)用量0.2%(v/v),液比3∶1,升溫時(shí)間40min,最高溫度160～180℃。預(yù)處理在Parr4848型間歇式壓力反應(yīng)釜中進(jìn)行,在保溫階段每5min取樣一次。1.3atr傳感器的光學(xué)特性ATR傳感器使用一個(gè)0.2mm×20mm×65mm的石英板作為內(nèi)部反射元件,其折光率為np,遠(yuǎn)高于周圍介質(zhì)的折光率(ns)。光從與石英板邊緣呈銳角θ的方向射入,到達(dá)石英板與介質(zhì)的邊界后發(fā)生反射。在每一個(gè)反射點(diǎn),總會(huì)有一部分光透過邊界被介質(zhì)吸收,內(nèi)部反射光逐漸衰減,并由分光光度計(jì)記錄衰減的強(qiáng)度。ATR-UV吸收光譜的一次透光率(T)符合朗伯比爾定律:Τ=ΙΙ0=Exp(-ε?C?be)=Exp(-a),(1)T=II0=Exp(?ε?C?be)=Exp(?a),(1)其中,I和I0分別是樣品與空白的光譜強(qiáng)度,ε是吸光系數(shù),C是待測樣的濃度,be是有效光程長。與普通的UV吸收光譜不同,ATR光譜中的有效光程(be)由入射光波長、介質(zhì)折光率、入射角等多個(gè)因素決定,其中介質(zhì)折光率起主要作用。介質(zhì)的折光率又決定于測試溫度、吸光和非吸光物質(zhì)的濃度。如果忽略反射造成的光強(qiáng)度損失,ATR傳感器z次反射的透光率可以寫成下式:Tz=[Exp(-a)]z=Exp(-za)=Exp(-z·ε·C·be)。(2)ATR每次反射的光程長約為1～2μm,通過改變反射次數(shù)可以調(diào)節(jié)有效光程長,并提高ATR的靈敏度。借用普通UV吸收光譜中吸收值的定義,z次反射的ATR光譜吸收值可以寫成與物質(zhì)濃度c成正比的形式:aΖAΤRZATR=-LnTz=za=z·ε·C·be。(3)需要說明的是,be主要取決于介質(zhì)的折光率,由待測物質(zhì)的濃度決定,因此,當(dāng)濃度范圍過大,濃度過高時(shí),不能得到吸收值與濃度的線性關(guān)系。對(duì)于多組分樣品,在特定波長(λ)下,ATR吸收值可看成由各組分吸收值的線性加和,Aλ=k·z[(ε1C1+ε2C2+…+εnCn)·be(C1,C2,…,Cn,λ)]。(4)生物抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及亞硫酸鹽預(yù)處理廢液通過一個(gè)Teflon管(總體積約1.2mL)泵送進(jìn)入ATR傳感器,使用Agilent8453型UV-Vis分光光度計(jì)記錄ATR-UV光譜(波長范圍200～400nm)。本文所列出的光譜強(qiáng)度均為3次測試所得的平均值。2結(jié)果與討論2.1atr-uv光譜檢測糠醛、HMF和木素磺酸鹽的ATR-UV光譜如圖1所示?？啡┖虷MF分別在230nm/280nm和230nm/286nm處有兩個(gè)吸收峰,它們?cè)?80nm附近吸收值比230nm處大得多。木素磺酸鹽在230nm處有吸收較強(qiáng)的肩峰,在280nm處的吸收峰較弱且平坦。與木素磺酸鹽相比,桉木亞硫酸鹽廢液的ATR-UV光譜在230nm和280nm處吸收較強(qiáng),并且280nm處的吸收峰向長波長方向移動(dòng),這些特征表明廢液中含有糠醛類物質(zhì)。無機(jī)鹽類物質(zhì)也可能引起ATR-UV光譜吸收的增強(qiáng)。在酸性亞硫酸鹽過程中,主要的無機(jī)鹽離子是Na+、H+、HSO3-、SO32-和SO42-,但只有HSO3-、SO32-在常用的濃度范圍內(nèi)會(huì)引起光譜吸收的明顯增強(qiáng)。圖1表明,HSO3-和SO32-在紫外區(qū)200～210nm有顯著吸收。由于糠醛和HMF在短波長紫外區(qū)域(波長<230nm)幾乎無吸收,可用215nm處的光譜強(qiáng)度進(jìn)行木素磺酸鹽的定量分析。2.2表面活性劑對(duì)酸性體系中木素的吸附ATR傳感器與石英比色皿對(duì)紫外光的折射率是一樣的,因此,可以將其看成是光程長約為1～2μm的“超薄”比色皿。但隨之而來的問題是,任何物質(zhì)在ATR傳感器上的吸附都可能造成測量的誤差。圖2顯示了木素磺酸鹽在酸性(pH2)條件下的動(dòng)態(tài)吸附。在20min內(nèi),木素磺酸鹽在ATR石英板上吸附層的濃度隨時(shí)間持續(xù)增加,因此,ATR-UV光譜法不適宜直接測定酸性體系中的木素含量。加入表面活性劑(圖2a)或NaOH(圖2b)可有效解決這個(gè)問題。(a)加入十二烷基磺酸鈉圖2a顯示加入陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)后,木素磺酸鹽在ATR傳感器表面的吸附層濃度顯著下降。當(dāng)SDS用量超過100mg/L時(shí),吸收值在1min后趨于穩(wěn)定;當(dāng)用量超過500mg/L時(shí),SDS幾乎可以完全阻止木素磺酸鹽的吸附。圖2b顯示加入適量的NaOH使木素磺酸鹽的pH穩(wěn)定在6～8之間也可以消除木素磺酸鹽吸附對(duì)測量產(chǎn)生的影響。由215、230和280nm處的動(dòng)力學(xué)曲線可知,中性的木素磺酸鹽溶液進(jìn)入ATR傳感器約30s后即可達(dá)到穩(wěn)定的吸收值。換言之,ATR-UV法測量亞硫酸鹽廢液中的木素磺酸鹽需要30s,這遠(yuǎn)低于亞硫酸鹽制漿或亞硫酸鹽生物質(zhì)預(yù)處理所需的時(shí)間,因此,ATR可以看作是一個(gè)具有實(shí)時(shí)測量功能的傳感器。2.3預(yù)處理廢液中反應(yīng)物質(zhì)的吸光系數(shù)木素磺酸鹽、糠醛和HMF的校準(zhǔn)曲線如圖3所示。對(duì)三種物質(zhì)而言,其光譜強(qiáng)度與濃度均呈線性關(guān)系,其關(guān)系式可表示如下:A=ε·c,(5)其中,ε為糠醛和HMF的摩爾吸光系數(shù)或木素磺酸鹽的質(zhì)量吸光系數(shù)。木素磺酸鹽、糠醛和HMF在不同波長處的吸光系數(shù)如表1所示。木素磺酸鹽對(duì)短波長(200～250nm)的紫外光響應(yīng)值高,本文選用215nm可以避免HSO3-、SO32-等無機(jī)鹽離子干擾。此外,在典型的桉木酸性亞硫酸鹽預(yù)處理廢液中,糠醛類物質(zhì)的總摩爾濃度一般小于0.10mol/L,木素磺酸鹽的質(zhì)量濃度約30g/L。因此,糠醛類物質(zhì)引起的誤差小于6.0%。(a)木素磺酸鹽1.對(duì)于糠醛和HMF,摩爾吸光系數(shù)ε的單位是mol·L-1;對(duì)于木素磺酸鹽,ε的單位是mL·g-1。2.4糠醛類物質(zhì)b糠醛和HMF在220nm和286nm處的吸光系數(shù)非常相近,可近似當(dāng)成同一種物質(zhì)。利用這兩個(gè)等吸收點(diǎn)建立雙波長校準(zhǔn)法可同時(shí)測量木素磺酸鹽與糠醛類物質(zhì)的總量,如式(6)所示。[A220A286]=[ε220,Lε286,L]?cL+[ε220,F′ε′286,F′]?cF′,(6)其中,ε220,F′和ε286,F′為總糠醛類物質(zhì)在220nm和286nm處的吸光系數(shù),分別為2.317mol/L和0.310mol/L。雙波長校準(zhǔn)法無法分別計(jì)算出糠醛和HMF的濃度,但可以消除糠醛對(duì)測量木素磺酸鹽的干擾。在桉木亞硫酸鹽預(yù)處理廢液中,HMF相對(duì)于糠醛的濃度低于15%,雙波長校準(zhǔn)法可滿足較低精確度的檢測要求。2.5實(shí)驗(yàn)方法的建立張翠等使用272、276、325nm三波長UV光譜法同時(shí)測定糠醛和HMF的濃度?？紤]到酸性亞硫酸鹽預(yù)處理廢液中木素磺酸鹽在ATR-UV光譜中,280nm處有較強(qiáng)吸收,而且求解三階矩陣較為復(fù)雜,因此我們采用255、270和286nm處的光譜強(qiáng)度來建立一種簡化的三波長校準(zhǔn)方法。[A255A270A286]=[ε255,Lε270,Lε286,L]?cL+[ε255,Fε270,Fε286,F]?cF+[ε255,Ηε270,Ηε286,Η]?cΗ。(7)如表1所示,木素磺酸鹽在這三個(gè)波長處的吸光系數(shù)ε很接近,可視為一個(gè)相同的值ε′。則可得:[A286-A255A286-A270]=[ε286,F-ε255,Fε286,F-ε270,F]?cF+[ε286,Η-ε255,Ηε286,Η-ε270,Η]?cΗ。(8)式(8)可分別得到糠醛和HMF的濃度。誤差的主要來源是木素磺酸鹽在255、270和286nm處吸光值的不同。由于木素磺酸鹽對(duì)250～300nm的紫外光不敏感,因此由木素磺酸鹽引起的誤差很小。2.6亞硫酸鹽廢液檢測:單波長法與三波長校準(zhǔn)法采用三種校準(zhǔn)方法檢測亞硫酸鹽廢液中已知濃度的木素磺酸鹽、糠醛和HMF,所得結(jié)果示于圖4和圖5。圖4顯示,單波長和雙波長校準(zhǔn)法都可得到準(zhǔn)確的木素磺酸鹽的濃度。單波長校準(zhǔn)法的線性相關(guān)性更接近1。由于校正了糠醛等物質(zhì)的干擾,雙波長法測量的數(shù)據(jù)略低,但誤差較小。三組平行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于±2.5%。應(yīng)用于酸性亞硫酸鹽廢液時(shí),單波長校準(zhǔn)法得到的數(shù)據(jù)與雙波長校準(zhǔn)法得到的數(shù)據(jù)一致。這表明,在亞硫酸鹽生物質(zhì)預(yù)處理過程中,HSO3-和SO32-離子和糠醛類物質(zhì)對(duì)于木素磺酸鹽的檢測無明顯影響?？啡┖虷MF的濃度可由雙波長和三波長校準(zhǔn)法得到。兩種方法測量值與高效液相色譜法(HPLC)測定的數(shù)據(jù)具有較高的線性相關(guān)性?？紤]到亞硫酸鹽制漿和酸性亞硫酸鹽預(yù)處理過程中都以保留纖維素為目的,糠醛類物質(zhì)生成的總量能反映半纖維素糖類的降解程度。值得一提的是,不同的生物質(zhì)得到的木素磺酸鹽其ATR-UV光譜特性可能不同,因此,在后續(xù)的工作中仍需要分析木素磺酸鹽的種類對(duì)ATR-UV光譜測試方法的影響。2.7溫度對(duì)亞硫酸鹽脫木素的影響在亞硫酸鹽預(yù)處理過程中,木素的降解在升溫階段即已發(fā)生(圖6a)。在三種溫度條件下,升溫階段與保溫階段脫除木素的量相當(dāng)。升溫至180℃的過程中,降解溶出的木素量可達(dá)到25%,相當(dāng)于在170℃反應(yīng)20min的結(jié)果。亞硫酸鹽脫木素反應(yīng)的程度受溫度的影響十分明顯。在160℃溫度下保溫10min后,脫木素率穩(wěn)定在12%左右不再有明顯增加;在180℃溫度下保溫20min左右,木素脫除率即達(dá)到一個(gè)臨界值(34%)。因此,從脫木素程度來看,亞硫酸鹽預(yù)處理的保溫時(shí)間不需要超過20min。圖6b中顯示了預(yù)處理保溫階段糠醛和HMF隨時(shí)間的增長。在160℃和170℃條件下,保溫15min以內(nèi)糠醛總量的增加不明顯。但溫度為180℃時(shí),升溫階段產(chǎn)生的糠醛總量已達(dá)到0.05mol/L,相當(dāng)于3%左右的單糖發(fā)生了降解。保溫30min后,大約6%的碳水化合物單糖降解成為糠醛或HMF。